إصلاح نموذج الحرجة الحجم عيب قبي طريق الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية المقطوع Lipoaspirate

Summary

هذا البروتوكول يصف عزل الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية lipoaspirate وإنشاء عيب 4 مم الحرجة الحجم قبي لتقييم تجديد الهيكل العظمي.

Abstract

إصلاح الهيكل العظمي القحفي وتجديد عروض الوعد تشكيل الأنسجة دي نوفو من خلال نهج يستند إلى الخلية باستخدام الخلايا الجذعية. وقد أثبتت الدهنية المستمدة من الخلايا اللحمية (مخولا لصيانة طائرات) لتكون مصدرا للخلايا الجذعية وافرة متعددة القدرات قادرة على تمر المكونة للعظم، والتمايز مكون للغضروف، مكون الشحم، وعضلي. واستكشفت العديد من الدراسات إمكانية المكونة للعظم هذه الخلايا في الجسم الحي مع استخدام المواد الحيوية المختلفة سقالات للتسليم الخلوية. وقد تجلى ذلك من خلال الاستفادة من ذلك osteoconductive، هيدروكسيباتيت المغلفة بولي (اللبنيك-CO-الجليكوليك حمض) (HA-PLGA) سقالة مع المصنف مخولا لصيانة طائرات، عيب الحرجة الحجم قبي، عيب التي تم تعريفها بواسطة عدم قدرتها على الخضوع عفوية يمكن الشفاء على مدى عمر الحيوان، أن تظهر على نحو فعال تجديد عظمي قوي. هذا نموذج الجسم الحي في يدل على أساس النهج متعدية تهدف لتجديد أنسجة العظام - الخلويةوعنصر مصفوفة البيولوجية. هذا الأسلوب يخدم كنموذج لتطبيق السريرية النهائي للخلية السلف نحو إصلاح خلل الأنسجة محددة.

Protocol

1. عزل الخلايا والتوسع

1. واستعرضت جميع وموافقة المريض البروتوكولات التجريبية والتي وافق عليها مجلس جامعة ستانفورد المراجعة المؤسساتي (البروتوكول # # 2188 و9999).
2. الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشري من الإجراءات الانتخابية تحت lipoaspiration المحلية / التخدير العام.
3. سيكون هناك طبقتين في lipoaspirate (الشكل 1A). طاف يحتوي على الغالبية العظمى من المواد الخلوية المصنعة. في الغالب يتم حقن الطبقة السفلية المالحة. الدهنية المشتقة يمكن أن تحصد من الخلايا اللحمية إما طبقة، ولكن العائد أكبر بكثير من طاف.
4. لعزل جزء اللحمية الأوعية الدموية (SVF)، وغسل lipoaspirate على نطاق واسع مع أحجام متساوية من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تحتوي على 2.5٪ betadine (X2)، تليها حجم مساو من 1X PBS (X1) دون betadine. السماح لغسل الراسب.
5. كن حذرا للحفاظ على الشركة المصرية للاتصالات عقيمةيمكن chnique في جميع مراحل العملية والتلوث مع الأنسجة البشرية المجهزة يحدث.
6. نضح الطبقة السفلية وتجاهل بعد كل غسل.
7. قسامة 15 مل من الأنسجة الدهنية في 50 مل أنابيب الصقر BD المخروطية.
8. هضم الأنسجة الدهنية مع حجم مساو (15 مل) من تصفية 0،075٪ النوع الثاني كولاجيناز في الحل هانك ملح المتوازن (HBSS) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 60 دقيقة تحت التحريض المستمر (حوالي 180 يهز / دقيقة) - كل أنبوب تهوية كل 15 دقيقة.
9. تحييد نشاط انزيم مع 15 مل PBS تحتوي على 10٪ (مصل بقري جنيني) FBS، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية للحصول على الكثافة العالية SVF بيليه. سوف يكون بيليه مزيج من الخلايا الدهنية المشتقة اللحمية والكريات الحمراء.
10. تجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
11. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من وسائط النمو التقليدية (Dulbecco في النسر متوسطة معدلة [DMEM] / 10٪ FBS / 1٪ البنسلين الستربتوميسين الحل).
12. مرشح suspen سيون من خلال مصفاة الخلية ميكرومتر 100 النايلون لإزالة الحطام الخلوية.
13. الجمع بين 3 أنابيب نظيفة في واحدة مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4
14. تجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
15. إعادة تعليق بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام التقليدية النمو
16. الجمع بين كل منهما 50 مل لكل conicals لوحة واحدة 10 سم أو خمسة conicals 50 مل لوحة واحدة 15 سم.
17. إنشاء الثقافات الأولية بين عشية وضحاها في 37 درجة C/21٪ O _2، 5٪ CO _2.
18. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، تغسل الصحون على نطاق واسع مع PBS لإزالة المتبقي غير ملتصقة خلايا الدم الحمراء. السكان الخلية الدهنية الناتجة المستمدة من الخلايا اللحمية.
19. الحفاظ على خلايا في شبه متموجة المستويات لمنع التمييز التلقائي عند 37 درجة C/21٪ O _2، 5٪ CO ₂ في وسائل الإعلام النمو. الخلايا عموما بحاجة إلى أن تنقسم كل ثلاثة أو أربعة أيام في وسائل الإعلام العادية النمو عند التقاء في مطلي 50٪.

ve_title "> 2 إعداد سقالة.

1. وأدلى الدكتور السقالات مين لي في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس - كلية طب الأسنان.
2. ملفقة من السقالات PLGA 85/15 بولي (حمض اللبنيك الجليكوليك-CO-) (اللزوجة الكامنة = 0.61 غ / دل، البوليمرات برمنغهام) من الصب والمذيبات عملية الترشيح الجسيمات.
3. كانت مختلطة PLGA / كلوروفورم حلول مع 200-300 ميكرون السكروز قطر للحصول على 92٪ المسامية (آسر الحجم)، وضغطها في صفائح رقيقة في قالب تفلون.
4. بعد تجميد التجفيف بين عشية وضحاها، ومنغمسين في السقالات ثلاثة تغييرات المزدوج المقطر (د د) O ₂ H حل السكروز، وإزالة بلطف من لوحة تفلون مع ملعقة غرامة الإكراميات.
5. بعد تسرب الجسيمات، وتطهير جميع السقالات عن طريق الغمر في 50٪، 60٪ والإيثانول 70٪ لمدة 30 دقيقة لكل منهما، تليها ثلاث يشطف من DDH ₂ O.
6. وجفت كل السقالات تحت غطاء محرك السيارة الصفحي تدفق.
7. بعد تلفيق سقالة، قوالمغلفة مع caffolds الأباتيت.
   1. وقد أعد SBF (محاكاة السوائل في الجسم) حل مع تركيز ايون التي كانت 5 مرات من بلازما الدم البشري. وكانت كل الحلول العقيمة التي تمت تصفيتها من خلال غشاء 0،22 ميكرون PES (Nalgene). مباشرة قبل عملية الطلاء، والمجففة تعرضوا لتصريف السقالات PLGA توهج، الأرجون البلازما النقش (Harrick العلمية) لتحسين الرطوبة والتوحيد الطلاء.
   2. ثم حضنت محفورا في السقالات PLGA SBF في 37 ° C داخل الحاضنة بالماء لمدة 12 ساعة تغلف، تليها المغنيسيوم ^{2 +} وHCO ₃ ^- 2 لSBF مجانا آخر ساعة 12 في 37 ° C تحت التحريك لطيف.
   3. وتشطف المغلفة السقالات PLGA بلطف مع العقيمة O ₂ DDH ليغسل فائض محلول كلوريد الصوديوم، والمجففة في الصفحي هود تدفق وتطهيرها مع الايثانول 70٪.
   4. تم تحليل سلامة طلاء الأباتيت مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). الأباتيت المغلفة هيئة السلع التموينيةوشنت ffolds على بذرة SEM (تيد بيلا) والمغلفة مع الكربون لتحسين التوصيل. تم تطبيق وضع الإلكترون الثانوية خلال الملاحظة (FEI / فيليبس XL-30) SEM. تم الحصول على الطاقة تشتت الأشعة السينية الطيف لتأكيد التركيب العنصري للهياكل الأباتيت.

3. خلية البذر

1. عند بلوغ مستويات التقاء الفرعية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني (X2) ويعرض للتريبسين.
2. عد الخلايا لتحديد لبذر
3. البذور على السقالات قبل قطع 4،0 مم مع 1.5 X ⁵ 10 خلايا.
   1. المكان الفردية سقالة في بئر من لوحة جيدا 96-
   2. اعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام العادية النمو مع تركيز تقريبا 1.5 × ⁵ 10 خلايا لكل 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام
   3. الماصة 20 ميكرولتر مباشرة على سقالة والمكان إلى خلية حاضنة الثقافة لمدة 30 دقيقة.
   4. بعد 30 دقيقة، أضف 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام والسماح لاحتضان الخلاياعلى منصة الاعدام قبل ليلة وضحاها لجراحة
   5. فإنه ليس من الضروري لضمان التصاق الخلايا على السقالة والبذر عدد كاف من خلايا سيضمن أن أغلبية سوف نعلق على السقالة. تم التحقق من صحة هذا الأمر في المختبر لدينا في الجسم الحي مع تلألؤ بيولوجي والتحليل النسيجي.

4. إنشاء العيوب قبي وزراعة فيفو

1. تخدير الكبار (60 يوما) CD-1 الفئران عارية مع كوكتيل مخدر. (الكيتامين / زيلازين / آسيبرومازين) في تركيز 50٪ (1:1 مع تخفيف كلوريد الصوديوم 0.9٪) أو في نظام مخدر الموصى بها في البروتوكولات المؤسسة. هذه الفئران هي athymic حتى hASCs لن يسبب رد فعل المناعة.
   1. الجرعة: هيدروكلوريد الكيتامين (80 ملغ / كغ)، زيلازين (2.5 ملغ / كلغ) آسيبرومازين (2.5 ملغ / كغ)
   2. مدة التنفيذ: حوالي 30 دقيقة
2. ثنى جراحيا الحيوان وتعقيم جراحيموقع مع betadine والكحول (X3)، وتغطي عيون الفأر مع مرهم قبل اتخاذ شق خط الوسط السهمي في فروة الرأس من الحيوان لفضح عظم الجداري الأيمن. إزالة pericranium من عظم الجداري الأيمن مع تجريف فظة (1B الشكل).
3. إنشاء من جانب واحد 4-مم سمك كامل عيب في حق غير قابل للخياطة عظم الجداري المرتبطة باستخدام معقم حفر منقب المغلفة الماس بت. يجب أن تؤخذ بحذر المتطرفة عدم تعكير صفو الأم الجافية الأساسية (1B الشكل) وسمك الماوس قبي هو <0.3 مم.
4. قبل زرع، وشطف مع السقالات PBS معقمة لمنع نقل عوامل النمو المشتقة من المتوسط.
5. وضع سقالة في العيب.
6. وأخيرا، خياطة الجلد مغلقة ومراقبة الحيوانات في بروتوكولات ما بعد الجراحة المقررة.
7. استخدام تسكين أنشئت وفقا لتوجيهات البروتوكولات الخاصة بك رعاية الحيوانات حسب الحاجة بعد العملية، على سبيل المثال. البوبرينورفين 0.1 ملغ / كز.

5. الكمي لتشكيل عظمية

1. بعد تم تنفيذ MicroCT على الماوس، أعيد بناء صورة ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج MicroView كما هو موضح سابقا ^1.
2. باستخدام أدوبي فوتوشوب، كانت الصور الحجم إلى ارتفاع قياسي.
3. باستخدام ميزة العصا السحرية، تم قياس بكسل من العيب قبي.
4. تم تحديد نسبة الشفاء من عيب لاحقة الأشعة المقطعية بقياس منطقة قبي عيب وتحديد عدد بكسل وتقسيمه من حيث عدد العيب الأصلي بكسل
5. وبناء على ذلك، إذا كان MicroCT غير متوفر، والبديل هو استخدام أدوبي فوتوشوب وحصاد calvaria في نقاط زمنية تحدد لعلم الأنسجة.
6. باستخدام البقع النسيجية مثل الأزرق والأنيلين التي تدل Pentachrome تشكيل عظمية، ينبغي مقاطع متعددة على طول مدى الخلل يكون الملون
7. باستخدام أدوبي فوتوشوب، والمحاصيل خارج جميع المناطق التي ليستعيب في قبي
8. استخدام ميزة عصا سحرية وتحديد أعداد بكسل تكوين العظام دي نوفو في مجال العيب وقارن بين عناصر التحكم أو متغيرات أخرى.

6. ممثل النتائج

الأنسجة الدهنية لديه القدرة على خدمة دورا حيويا في توليد الخلايا الاصلية للتطبيق السريرية. الأنسجة الدهنية لديه ميزة فريدة من نوعها في وجود إمدادات متاحة بسهولة التي يمكن حصادها في إجراء بسيط نسبيا، والتي تنطوي على الحد الأدنى من الاعتلال والوفيات. مرة واحدة يتم حصاد الأنسجة والتي تم جمعها، ويرد بروتوكول لدينا في الشكل 2. يتم عزل الدهنية المستمدة من الخلايا اللحمية من خلال سلسلة من الخطوات الغسيل، والهضم كولاجيناز، والطرد المركزي. مرة واحدة ومطلي الخلايا في الثقافة، ويمكن التوسع فيها، وضعت في مختلف البروتوكولات التمايز في المختبر، أو وضعها مباشرة في الجسم الحي.

جreation من عيب الحرجة 4 مم حجم قبي يوفر الوصول إليها بسهولة وقابلة للتكرار في نموذج الجسم الحي لاختبار قدرة التمايز المكونة للعظم من الخلايا الدهنية المشتقة لدينا اللحمية. من خلال استخدام MicroCT، ونحن قادرون على متابعة تكوين أنسجة الهيكل العظمي في الجسم الحي وتتبع التقدم المحرز في تدخلاتنا (الشكل 3). والعيب الحرجة حجم قبي لا تلتئم في غضون فترة حياة الحيوان ونرى ما يقرب من 90٪ من براءات الاختراع في جميع أنحاء عيب يبقى 8 أسابيع. السقالة نفسها (انظر المناقشة) له خصائص الاستقرائي المكونة للعظم وأظهرت القدرة على إحداث بعض التجديد العظمية. نتائج نموذجية من دون وضع سقالة الخلايا تظهر ان نحو ثلث العيب سيكون دي نوفو في تكوين العظام 8 أسابيع. مع زيادة الخلايا الدهنية من المشتقة اللحمية، تماما سوف الثلثين أو أكثر من عيب تظهر تجديد عظمي في حوالي 8 أسابيع على الرغم من أن هناك variability بين كل حيوان والجراحة. يمكن كميا تشكيل الهيكل العظمي الأنسجة من خلال الأنسجة والنتائج النموذجية تظهر زيادة في تشكيل عظمية عينات مع مخولا لصيانة طائرات من خلال تلطيخ الأزرق الأنيلين وPentachrome (الشكل 3C). وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن الخلايا المزروعة الإنسان تساهم في تكوين عظمي دي نوفو الكامنة من خلال استخدام hASCs GFP التي تحمل علامات التي تظهر في الجسم الحي في تلطيخ 2 أسابيع في منطقة قريبة من تشكيل العظام دي نوفو في عيب قبي (الشكل 3D) . وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم المناعية الأجسام المضادة المحددة مع الإنسان لإظهار بقاء الخلية البشرية والمساهمة في مجال الخلل (الشكل 3E).

الشكل 1 A -. lipoaspirate واثنين من طبقات. الطبقة العليا يحتوي على الخلايا الشحمية والغالبية العظمى من العلاقات العامةocesses المواد الخلوية في حين أن الطبقة السفلى تحتوي على محلول ملحي المستخدمة أثناء إجراء lipoaspiration. ب - إنشاء عيب قبي من خلال شق خط الوسط خلال pericranium لعزل عظم الجداري الأيمن، بعد ذلك إقامة من 4 مم الحجم عيب الحرجة قبي دون انقطاع من الأم الجافية الأساسية.

الشكل 2. نظرة عامة على الحصاد وتطبيق lipoaspirate من عزل الخلايا الدهنية المشتقة من انسجة لالتمايز، والتوسع في استخدام والتجارب المختبرية والحية.

الشكل 3. A-MicroCT تظهر في الجسم الحي الشفاء من عيب الحرجة حجم قبي مع تطبيق مخولا لصيانة طائرات من خلال HYDroxyapatitie سقالة (الصف السفلي). الضوابط تشمل أي سقالة وعيب (الصف العلوي) وعيب في موضع دون سقالة الخلايا (الصف الأوسط) B - التحديد الكمي للشفاء عظمي من MicroCT تظهر زيادة كبيرة في الشفاء المجموعة ASC. C - علم الأنسجة يظهر تشكيل عظمية زيادة للفريق ASC (الصف السفلي) من خلال تلطيخ الأزرق الأنيلين وPentachrome. لالأنيلين الأزرق، والأزرق الداكن البقع عظمية وPentachrome، والبقع الصفراء عظمية. D - كانت المصنفة المسمى مع GFP hASCS في الصعود إلى منصة الاعدام، ووضع في خلل قبي وضحت في 2 أسابيع. وقد تم تلطيخ مع GFP المسمى الأجسام المضادة لإظهار الخلايا البشرية التي تسهم في تجديد في مجال الخلل. E -. الإنسان المناعية المستضدات النووية تظهر انتشار الخلايا البشرية في مجال الخلل في 2 أسابيع اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Discussion

منذ عزل الدهنية المستمدة من الخلايا اللحمية ² من lipoaspirate، وقد تختلف هذه الخلايا في مجموعة متنوعة واسعة من الأنساب الخلوية. الأنسجة الدهنية هي من أصول أرومية متوسطة، وبالتالي، متعددة القدرات الدهنية المشتقة من الخلايا اللحمية من المرجح أن تكون الأكثر فعالية مع ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف:	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
			Lipoaspirate الحصاد
PBS	Gibco	10010-023
هانك محلول الملح المتوازن	Cellgro	21-023-CV
كولاجيناز	سيجما	C6885-500MG
الخلية مصفاة 100 ميكرون	BD الصقر	352360
Steri أعلى 500 مل 0.22 ميكرون فلتر	ميليبور	SCGPT05RE
			قبي عيب
Z500 فرش MicromotorsUM50C	NSK	NSKZ500
التعميم سكين 4.0 ملم	Xemax الجراحية	CK40