Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Özet

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Özet

Kraniyofasiyal iskelet onarımı ve yenilenmesi kök hücreleri kullanan bir hücre-temelli bir yaklaşım ile de novo doku oluşumu vaadi sunar. Yağ-kaynaklı stromal hücreler (TSK) osteojenik, kondrojenik adipojenik ve miyojenik farklılaşma geçiren yeteneğine multipotent kök hücrelerin bol bir kaynağı olduğu kanıtlanmıştır. Pek çok çalışma hücresel teslim için çeşitli yapı iskelesi biyomalzemelerin kullanımı ile in vivo olarak bu hücrelerin osteojenik potansiyel araştırdılar. Bu gibi olduğu gösterildi bir osteokondüktif, hidroksiapatit-kaplı poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA-HA) TSK ile iskele tohumlu, bir kritik boyutlu kalvaryal kusur, kendiliğinden geçmesi için kendi yetersizlik ile tanımlanan bir bozukluk kullanılarak , hayvanın ömrü boyunca şifa etkili sağlam kemik rejenerasyon göstermek olabilir. Bu in vivo modelde kemik dokusu yenilenmesine yönelik translasyonel yaklaşım esas göstermektedir - hücreselbileşeni ve biyolojik matrisi. Bu yöntem, bir doku spesifik kusurun tamir yönelik bir projenitör hücre nihai klinik uygulama için bir model olarak hizmet vermektedir.

Protokol

1. Hücre İzolasyonu & Genişletme

1. Tüm hastanın rızası ve deneysel protokolleri Stanford Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (Protokol # 2188 ve # 9999) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
2. Genel / lokal anestezi altında elektif lipoaspiration prosedürlerden İnsan subkutanöz adipoz dokusu elde edilir.
3. Lipoaspirate iki kat (Şekil 1A) olacaktır. Süpernatant işlenmiş hücresel malzemenin büyük bir çoğunluğu içerir. Alt tabaka daha çok tabaka ya da stromal hücreler hasat edilebilir Yağ-türetilmiştir. Salin enjekte, ancak verimi üstte yüzen madde gelen çok daha büyük olmasıdır.
4. Stromal vasküler fraksiyonu (SVF) izole etmek için, 1X eşit hacimlerde salin (PBS) betadin olmadan 1X PBS (x1) eşit hacmi ardından% 2.5 betadin (x2) içeren fosfat tamponlu ile yoğun lipoaspirate yıkayın. Çökelti için yıkama izin verin.
5. Steril te korumak için dikkatli olunişlenmiş insan dokusu ile karışması süreci boyunca chnique olabilir.
6. Alt tabaka aspire ve her yıkamadan sonra atın.
7. Tablet 50 ml BD Falcon konik tüpler içine adipoz doku 15 ml.
8. 37 Hank Dengeli Tuz Çözeltisi içinde süzülmüş% 0.075 Tip II kollajenaz eşit bir hacmi (15 ml) bir (HBSS) ° C su banyosu içinde 60 dakika boyunca sürekli karıştırma altında (yaklaşık 180 / dak titreşim) ile adipoz doku sindirmek - Her bir tüp her 15 dk havalandırın.
9. 15 ml PBS ° C olan yüksek yoğunluklu bir SVF pelet elde etmek için 4, 5 dakika için 1000 rpm'de% 10 (Fetal Bovine Serum) FCS, ve santrifüj ile birlikte ihtiva eden enzim aktivitesini nötralize eder. Pelet adipoz-kaynaklı stromal hücreler ve eritrositler bir karışımı olacaktır.
10. Pelet aksatmadan Süpernatantı atın.
11. Geleneksel büyüme ortamı, 10 ml (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı [DMEM] /% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu) pellet yeniden süspanse edin.
12. Filtre Asma hücresel enkaz kaldırmak için 100 mikron naylon hücre süzgecinden sion.
13. Temiz bir 50 ml konik tüpler içine 3 birleştirin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüje
14. Pelet aksatmadan Süpernatantı atın.
15. Geleneksel büyüme ortam 5 ml pelet yeniden süspanse edin
16. Biri 10 cm tabak veya bir adet 15 cm tabak için beş 50 ml conicals başına iki 50 ml conicals birleştirin.
17. 37 ° C/21% O _2,% 5 CO ₂ gecede primer kültürlerinde oluşturulması.
18. Gecelik inkübasyon sonrasında rezidüel yapışmaz kırmızı kan hücreleri çıkarmak için PBS ile yoğun tabakları yıkamak. Ortaya çıkan hücre popülasyonlarının adipoz-kaynaklı stromal hücrelerdir.
19. 37 ° C/21% O _2,% 5 CO büyüme ortamı içinde ₂ spontan farklılaşma önlemek için alt-konfluent düzeyde hücreleri koruyun. Hücreler genellikle% 50 izdiham kaplama yaparken düzenli büyüme ortamı her üç dört gün ayırmak gerekir.

ve_title "> 2. İskele Hazırlık

1. Diş Hekimliği Fakültesi - İskelelerin California Üniversitesi'nden Dr Min Lee, Los Angeles tarafından yapılmıştır.
2. PLGA iskeleleri çözücü ve bir döküm parçacık süzme işlemi ile 85/15 poli (laktik-ko-glikolik asit) (doğal viskozite = 0,61 dl / g arasında, Birmingham Polimerler) imal edilmiştir.
3. PLGA / kloroform çözümleri% 92 gözeneklilik (hacim fraksiyonu) ve teflon kalıp içinde ince tabakalar halinde sıkıştırılmış elde etmek için 200-300 mikron çaplı sukroz ile karıştırılmıştır.
4. Gecede dondurularak kurutulduktan sonra, iskelelerinin sakaroz çözmek için çift distile (dd) H ₂ O üç değişiklik dalmış edildi ve nazikçe ince uçlu spatula ile teflon plaka kaldırıldı.
5. Parçacık süzme sonra, tüm iskeleleri GKD ₂ O. üç kez durulama ile takip 30 dakika her biri için en az% 50,% 60 ve% 70 etanol içinde daldırma ile dezenfekte edildi
6. Tüm iskeleleri bir laminer akış kaputu altında kurutuldu.
7. Sonra iskele imalat, scaffolds apatit ile kaplanmıştır.
   1. SBF (yapay vücut sıvısı) solüsyonu insan kan plazması 5 zamanlardı iyon konsantrasyonları ile hazırlanmıştır. Tüm çözümler bir 0.22 mikron PES membran (Nalgene) süzüldü steril edildi. Hemen kaplama işlemi öncesinde, PLGA iskeleleri ıslatma ve kaplama bütünlüğü geliştirmek için kızdırma deşarj, argon plazma aşındırması (Harrick Bilimsel) tabi tutuldu kurutulur.
   2. Kabartma PLGA iskeleleri daha sonra 37 SBF inkübe edildi ° Mg ^2, ardından 12 saat boyunca bir su ceketli kuluçka makinesi içinde C, ⁺ ve HCO _^3-37 az 12 saat boyunca serbest SBF 2 ° C'de hafif karıştırma altında.
   3. Kaplamalı PLGA iskelelerinin bir laminer akış kaputu kurutulur ve% 70 etanol ile dezenfekte aşırı sodyum klorür çözeltisi yıkayacak steril GKD ₂ O ile nazikçe yıkandı.
   4. Apatit kaplama bütünlüğü taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile analiz edildi. Apatit kaplı scaffolds SEM saplamaları (Ted Pella) üzerine monte edilen ve iletkenliğini artırmak için karbon ile kaplanmıştır. Ikincil elektron modu SEM (FEI / Phillips XL-30) gözlem sırasında uygulandı. Enerji dağılım X-ışını spektrumu apatit yapıları elementel bileşimi onaylamak için elde edilmiştir.

3. Hücre Seeding

1. Alt-izdiham düzeyleri ulaşan üzerine, PBS (x2) ile hücrelerin yıkayın ve Trypsinize.
2. Tohumlama için ölçmek hücreleri hesaplama
3. 1,5 x 10 ⁵ hücre ile pre-cut 4.0 mm çaplı iskeleleri üzerine Tohum.
   1. 96-kuyulu plakanın bir kuyu içine yerleştirin bireysel yapı iskelesi
   2. Ortam 20 ul başına yaklaşık 1.5 x 10 ⁵ hücrelerinin bir konsantrasyon ile normal büyüme ortamı içinde yeniden askıya hücrelerin
   3. 30 dakika süreyle hücre kültürü inkübatör içine Pipet 20 doğrudan iskele üzerine ul ve yer.
   4. 30 dakika sonra, ortam 200 ul ekle ve hücreler inkübe edincerrahi iskele bir gecede önce
   5. Bu hücrelerin yeterli sayıda tohumlu olarak iskele üzerine hücre yapışma çoğunluğu iskele üzerine takmak sağlayacaktır sağlamak için gerekli değildir. Bu biyolüminesans ve histolojik analizi ile in vivo laboratuarımızda onaylanmıştır.

4. Kalvaryum Hataları ve Vivo Ekiminde oluşturulması

1. Uyutmak yetişkin (60 günlük yaşta) anestezik kokteyl ile CD-1 çıplak farelerin. (Ketamin / xylazine / Acepromazine)% 50 konsantrasyonda (% 0.9 NaCl ile 1:1 seyreltme) veya kurum protokolleri başına önerilen anestezik rejime başına. HASCs bir immun reaksiyona neden olmayacak şekilde bu fareler atimik vardır.
   1. Dozaj: Ketamin hidroklorid (80 mg / kg), bir Xylazine (2.5 mg / kg) Acepromazine (2.5 mg / kg)
   2. Etki süresi: yaklaşık 30 dakika
2. Cerrahi hayvan asmak ve cerrahi sterilizebetadin ve alkol (x3) ile site ve önceki sağ parietal kemiğin açığa hayvanın derisi bir orta hat sagital insizyon yapma merhem ile fare gözlerinizi kapayın. Künt kazıma (Şekil 1B) ile sağ parietal kemik pericranium çıkarın.
3. Steril bir elmaslı trepan matkap ucu kullanarak doğru olmayan sütür ilişkili paryetal kemikte tek taraflı 4 mm tam kat defekt oluşturun. Extreme dikkatli fare kalvaryal kalınlığı gibi altta yatan duramater (Şekil 1B) rahatsız etmemek için dikkat edilmelidir <.3 mm.
4. Takılmadan önce, orta-türevi büyüme faktörü transferini önlemek için steril PBS ile iskelelerinin yıkayın.
5. Defekt içine iskele yerleştirin.
6. Son olarak, cilt kapatıldı sütür ve kurulan postoperatif protokoller başına hayvan izlemek.
7. Post-operatif-örneğin gerektiği gibi hayvan bakım protokolleri yönettiği olarak kurulmuştur analjezi kullanın. Buprenorfin 0.1 mg / kg.

5. Osteoid Oluşumu Kantitasyonu

1. MikroBT fare yapıldıktan sonra, üç-boyutlu bir görüntü daha önce tarif edildiği gibi ¹ MicroView yazılımı kullanılarak yeniden inşa edildi.
2. Adobe Photoshop kullanarak, görüntülerin standart bir yüksekliğe büyüklükte.
3. Sihirli Değnek özelliğini kullanarak, piksel kalvaryal kusuru ölçüldü.
4. Kusur yüzdesi şifa sonraki CT taramaları kalvaryal defekt alan ölçme ve piksel sayısının belirlenmesi ve orijinal defekt en piksel sayısına bölünmesiyle tespit edildi
5. MikroBT kullanılamaz Sonuç olarak, eğer bir alternatif Adobe Photoshop kullanarak ve histoloji için belirlenen zaman noktalarında kalvaryal hasat edilir.
6. Osteoid oluşumu ifade Anilin Mavisi ve pentakrom gibi histolojik boyalar kullanarak, defekt açıklığı boyunca birden çok bölüm lekeli olmalıdır
7. Adobe Photoshop, olmayan tüm alanları kırpma kullanmakalvaryal defekt
8. Sihirli değnek özelliğini kullanın ve defekt alanındaki de novo kemik formasyonu piksel numaraları belirlemek ve denetimleri veya diğer değişkenlere karşılaştırın.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Yağ dokusu klinik uygulama için progenitör hücrelerin üretimi hayati bir rol hizmet etmek için bir potansiyele sahiptir. Yağ dokusu minimal morbidite ve mortalite içeren nispeten basit bir prosedür içinde hasat edilebilir bir hazır kaynağı olduğunu benzersiz bir avantaja sahiptir. Dokusu hasat edilir ve toplanır başladığında, protokol Şekil 2 'de belirtilmiştir. Yağ-kaynaklı stromal hücreler bir çamaşır adım serisi, kollajenaz sindirim ve santrifüj yoluyla izole edilmiştir. Hücre kültürü içinde kaplanır sonra, bunlar, genişletilmiş, in vitro çeşitli protokoller farklılaşma içine yerleştirilmiş, ya da in vivo doğrudan yerleştirilebilir.

C4 mm kritik boyutlu kalvaryal defekt reation bizim adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin osteojenik farklılaşma yeteneğini test etmek vivo modelde bir kolay erişilebilir ve tekrarlanabilir sağlar. MikroBT kullanımı sayesinde, biz in vivo iskelet doku oluşumunu takip ve müdahalelerin ilerleme (Şekil 3) takip edebiliyoruz. Kritik boyutu kalvaryal kusur hayvanın yaşam süresi içinde iyileşme olmaz ve defekt kabaca 90% 8 hafta civarında patent kalır bakın. Iskele kendisi (tartışmaya bakınız) osteojenik indüktif özellikleri vardır ve bazı kemik rejenerasyonu teşvik etmek yeteneğini göstermiştir. Hücre içermeyen iskele yerleştirme tipik sonuçlar kusur yaklaşık üçte biri 8 hafta de novo kemik formasyonuna sahip olacağını göstermektedir. Iflkenlerin olsa adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin güçlendirme ile tam kusur üçte iki veya daha fazla 8 hafta civarında kemik rejenerasyonu gösterecektirHer hayvan ve cerrahi arasındaki ility. İskelet doku oluşumu histoloji yoluyla ölçülebilir ve tipik sonuçları Anilin Mavisi ve pentakrom boyanma (Şekil 3C) yoluyla TSK ile örneklerinde artmış osteoid oluşumu göstermek olabilir. Buna ek olarak, (Şekil 3D), implante edilmiş insan hücre kalvaryal kusur olarak de novo kemik oluşumu alan yakın 2 hafta sonra in vivo olarak boyanması göstermek GFP-etiketli hASCs kullanımı ile alt de novo kemik oluşumuna katkıda bulunduğunu göstermektedir . Buna ek olarak, hatanın alan (Şekil 3E) insan hücre hayatta kalma ve katkı göstermek için insan spesifik antikor ile immünohistokimyasal kullanır.

Şekil 1 A -. Lipoaspirate iki katmandan oluşmaktadır. Üst tabaka adipositler ve pr çoğunluğu içeriralt tabaka lipoaspiration işlem sırasında kullanılan salin içeren süre hücresel malzeme ocesses. B - yatan duramater kesinti olmadan sağ parietal kemik, bir 4 mm kritik büyüklükte kalvaryal defekt sonraki yaratılması izole pericranium üzerinde orta hat insizyonla kalvaryal defekt oluşturulması.

Şekil 2. Kendi genişleme, farklılaşma ve in vitro ve in vivo kullanıma adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin izolasyonu gelen lipoaspirate ve hasat ve uygulama genel bakış.

Şekil 3,. Bir hyd yoluyla TSK uygulaması ile önemli boyut kalvaryal kusur in vivo iyileşme gösteren bir-mikroBTroxyapatitie iskelesi (Alt Satır). ASC grubunda anlamlı bir artış iyileşme gösteren mikroBT gelen kemik iyileşmesiyle Kantitasyonu - Kontroller hücreleri (Orta Sıra) Yatak olmadan iskele yerleştirme ile hiçbir iskele ve defekt (Üst satır) ve kusur vardır. C - Histoloji Anilin Mavisi ve pentakrom boyama yoluyla ASC grubu (alt satır) artmış osteoid oluşumu gösteren. Anilin Mavi için, osteoid lekeler koyu mavi ve pentakrom, osteoid lekeler sarı için. D - GFP etiketli hASCS bir iskele üzerine tohumlandıklarında ve yerleştirilen bir kalvaryal defekt içine ve 2 hafta sakrifiye edildi. Boyama kusur alanında yenilenme katkı insan hücrelerini gösteren bir GFP etiketlenmiş antikor ile yapıldı. E -. 2 hafta defekt alanında insan hücreleri yaygınlık gösteren İnsan nükleer antijen immünhistokimya büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Ve izolasyonu yağ olarak türetilmiş lipoaspirate dan stromal hücreleri ^2, bu hücrelerin hücre soylarının çeşitli ayrışmıştır edilmiştir. Yağ dokusu mezodermal kökenlerden gelen ve bu nedenle, multipotent adipoz-kaynaklı stromal hücrelerin büyük olasılıkla bir mezodermal soy doğru uygulama ile en etkili olacaktır. İskelet doku oluşturmak için yeteneği verici bir otogreft için siteleri ve enfeksiyon, rejeksiyon ve zaman üzerinde ³ arızaları dahil sentetik malzemenin ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı:	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
			Hasat Lipoaspirate
PBS	Gibco	10010-023
Hank Dengeli Tuz Çözeltisi	Cellgro	21-023-CV
Kollajenaz	Sigma	C6885-500MG
Hücre Süzgeç 100 mikron	BD Falcon	352360
Steri-500 ml .22 mikron filtre	Millipore	SCGPT05RE
			Kalvaryum Kusur
Z500 Fırçasız MicromotorsUM50C	NSK	NSKZ500
Dairesel Bıçak 4,0 mm	Xemax Cerrahi	CK40