تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Summary

طرق لتنقية الكولسترول ملزمة السم ستربتوليزين O من المؤتلف E. القولونية والتصور من السم ملزمة للعيش الخلايا حقيقية النواة. تسليم المترجمة من السم يؤدي الى تغييرات سريعة ومعقدة في الخلايا المستهدفة يكشف جوانب جديدة من الأحياء السم.

Abstract

السموم البكتيرية ربط الكوليسترول في الأغشية، وتشكيل المسام التي تسمح لتسرب محتويات الخلوية وتدفق المواد من البيئة الخارجية. يمكن استرداد الخلية إما من هذه الإهانة، الأمر الذي يتطلب عمليات إصلاح غشاء بالموقع، وإلا يموت اعتمادا على كمية التعرض للسموم ونوع من الخلايا ^1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه السموم لحث على الاستجابة للالتهابات قوية في المضيفين المصابة من خلال تنشيط خلايا المناعة، بما في ذلك الضامة، والتي تنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات ^2. كثير من البكتيريا إيجابية الجرام تنتج السموم ملزمة الكوليسترول التي ثبت للمساهمة في الفوعة من خلال آليات uncharacterized إلى حد كبير.

التغييرات الشكلية في غشاء البلازما من الخلايا المعرضة لهذه السموم تتضمن تنحية بهم إلى السطح نتوءات الكولسترول عالي التخصيب، والتي يمكن تسليط في الفضاء خارج الخلية مما يدل على أن الدفاع الجوهرية الخلويةآلية ^3،4. هذه العملية تحدث في جميع الخلايا في حالة عدم وجود النشاط الأيضي، ويمكن تصور استخدام EM بعد ⁴ تثبيت الكيميائية. في الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية التي تتوسط الالتهاب ردا على التعرض للسموم، واقترح الحويصلات الغشاء يسببها لاحتواء السيتوكينات من عائلة IL-1 وربما تكون مسؤولة على حد سواء لسفك السم ونشر هذه السيتوكينات الموالية للالتهابات ^5،6،7. A الرابط بين IL-1β الإفراج ونوع معين من موت الخلايا، وقد اقترح تسميته pyroptosis، وكلاهما العمليات كاسباس-1 تعتمد ^8. لفرز تعقيدات هذا الرد البلاعم، والذي يتضمن ربط السم، متراجعا من الحويصلات الغشاء، وإطلاق سراح خلوى، وموت الخلايا يحتمل، وقد وضعنا أساليب التصنيف وطرق الفحص المجهري مضان التي تسمح لتصور الوقت الحقيقي من السم خلايا التفاعلات، بما في ذلك قياسات ضعف والموت (الشكل 1). استخدمالتصوير الخلية الحية ضروري بسبب قيود في تقنيات أخرى. ويمكن للنهج البيوكيميائية يتم تحليل التأثيرات التي تحدث في الخلايا الفردية، في حين أن التدفق الخلوي لا يقدم عالية الجودة، في الوقت الحقيقي التصور من الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لتحليل الحركية من الردود الناجمة عن المنبهات الأخرى التي تنطوي على تغييرات في الخلايا المعقدة المظهري.

Protocol

1. تنقية O ستربتوليزين (SLO)

1. تطعيم 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا التي تحتوي على BL21 GOLD-pBADgIII SLOhis البلازميد ⁹ الى 0.5 لتر مرق LB وإضافة 500 ميكرولتر 50 ملغ / مل الأمبيسلين. يهز نحو 225 دورة في الدقيقة الثقافة في C ° 37 حتى OD ₆₀₀ = 0.6، 1.5 ساعة ~ عادة. أجهزة الطرد المركزي 1 مل البكتيريا (يعتبر T ₀₎ في 10،000 XG 5 دقائق، ويحل بيليه في 140 ميكرولتر 1X العازلة عينة SDS / OD 1 و يصوتن لDNA لتحليل القص نقاء البروتين.
2. حمل البكتيريا مع إضافة 5 مل أرابينوز 20٪ إلى الثقافة، ويهز نحو 225 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة. جمع 1 مل من البكتيريا، الطرد المركزي وتذوب في المخزن المؤقت 1X عينة SDS على النحو الوارد أعلاه لT نقطة زمنية ₃ للتحليل النقاء.
3. جمع البكتيريا المتبقية في زجاجة 500 مل الطرد المركزي، وتدور 12000 XG لمدة 12 دقيقة في 4 درجات مئوية (8،500 دورة في الدقيقة الكتب التي GS-3 الدوار). صب طاف وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية خلال الليل أو لفترة أطول إذا لزم الأمر.
4. إعادة تعليق الابأوزين بيليه على الجليد في 10 مل ليز / اغسل العازلة (50 ملي ناه ₂ PO _4، 300 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0) تستكمل مع تريتون ميكرولتر 400 25٪ X-100، و 100 ميكرولتر 100 ملغ / مل الليزوزيم، 50 ميكرولتر phenylmethylsulfonyl 200 ملي مول الفلوريد (PMSF). نقل بيليه معلق إلى 50 مل أنبوب أوك ريدج.
5. يصوتن حلالة 5 مرات لمدة 30 ثانية على الجليد مع فترات ثانية 30. sonicated تدور المحللة في أنبوب أوك ريدج في 39000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية (18،000 دورة في الدقيقة الكتب التي SS-34 الدوار).
6. في حين أن المحللة هو الغزل، وغسل 1 مل ني NTA الاغاروز مع 10 مل ليز / اغسل العازلة وتدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. (جميع يغسل مزيد / elutions استخدام الطرد المركزي في ظل هذه الظروف). نضح غسل.
7. إضافة طاف البكتيرية من الخطوة 1.5 إلى ني NTA الاغاروز، يهز بلطف لمدة 2.5 ساعة في 4 درجات مئوية. تدور لجمع طاف. الجمع بين 30 ميكرولتر من طاف مع 10 μ 4X العازلة عينة SDS وانقاذ لتحليل النقاء. غسل الخرز 4 مرات في ليز / اغسل العازلة وعلىم في تريس / الملح العازلة (50 ملي تريس، 300 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0).
8. أزل 3 مرات بإضافة 1 مل العازلة شطف (250 ملي تريس في إيميدازول / الملح العازلة) و 5 ميكرولتر 1 M dithiothreitol (DTT) لالخرز، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة، والغزل وجمع طاف. SLO هو بروتين جدا الأكسدة حساسة، ويجب أن يبقى على الجليد في جميع الأوقات. خفضت مرة واحدة، سوف تفقد البروتين بسرعة نشاطها في حال ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية، ولو لفترة قصيرة من الزمن.
9. غسل 500 ميكرولتر polymixin، مترافق الاغاروز في المخزن المؤقت شطف، وتدور في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية و resuspend في 500 ميكرولتر. في استنزاف الذيفان الداخلي، أضف 200 ميكرولتر الخرز لكل شطف ويهز 4 ° C لمدة 30 دقيقة. تدور في 10،000 XG لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية، وحفظ طاف. الجمع بين 30 ميكرولتر من كل شطف مع 10 ميكرولتر العازلة عينة SDS 4X لSDS-PAGE التحليل.
10. اختبار نقاء elutions بواسطة SDS-PAGE. عينات للتحليل يغلي حفظ جل في C ° 95 ل5 دقائق وتحميل ميكرولتر 10 على هلام 10٪. وصمة عار جنرال الكتريكL مع Coomassie لتصور البروتين (الشكل 2A). SLO هو 69 كيلو دالتون. إجراء الفحص برادفورد لتحديد تركيز البروتين (العائد نموذجي هو 4 ملغ / مل لelutions الأولين، ولكن قد تختلف من سلالة البكتيرية وتستخدم بلازميد).
11. اختبار النشاط الانحلالي كل شطف (انظر أدناه). elutions بركة حيث النقاء والتركيز والنشاط الانحلالي مرضية. SLO قسامة في ذات الاستخدام الواحد مأخوذة (5-10 ميكرولتر عادة)، وتجميد الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. الفحص الدم الانحلالي

1. غسل الأغنام خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) في المخزن المؤقت الفحص RBC (0.3٪ مصل الألبومين البقري (BSA)، 2 مم CaCl _2، ملي Hepes 10، درجة الحموضة 7.4)، وتدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، و resuspend في كرات الدم الحمراء 2.5٪ في 10 الفحص RBC مل العازلة.
2. إضافة 10 ميكرولتر العازلة مقايسة RBC / بشكل جيد في لوحة أسفل V-96-جيدا على الجليد. تخفيف متسلسل كل شطف في مكررة. نطاقات التخفيف النموذجية هي 1:1،000 ل1:512،000. وتشمل 3 آبار مع عدم وجود السم والآبار 3 مع 10ميكرولتر تريتون X 2٪-100 والآبار الحد الأدنى والحد الأقصى، على التوالي.
3. لوحة غطاء واحتضان عند 37 درجة مئوية و 30 دقيقة. 1200 دورة في الدقيقة أجهزة الطرد المركزي في لمدة 5 دقائق. نقل 70 ميكرولتر من طاف لوحة مسطحة القاع جيدا 96. وجاء في _405. وحدة واحدة تتلخص في تخفيف السم اللازمة لتحلل 50٪ من كرات الدم الحمراء. النشاط السم هو 1 وحدة * التخفيف factor/0.01 مل.

3. الفحص الخلوي التحللي

1. خلايا الحصاد، العد، وتدور. إعادة تعليق على 2X10 ⁶ / مل في المخزن المؤقت R / B (مع RPMI 2 مم CaCl _2، 0.5٪ BSA) و 20 ميكروغرام / مل يوديد propidium. إضافة إلى 100 خلية ميكرولتر لوحة أسفل V-96-أيضا.
2. تخفيف متسلسل SLO إلى 2x تركيز النهائي في المخزن المؤقت R / B، إضافة 100 ميكرولتر السم أو 100 ميكرولتر العازلة R / B إلى الخلايا. احتضان 5 دقائق 37 ° C. مجموعة نموذجية تركيزات النهائي من 2،000 U / مل إلى 31.25 U / مل.
3. تشغيل الخلايا على قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات مع المرشحات للفيكوإيريترين (PE). وهناك تحول واحد سجل يمثل سل permeabilized عابرLS بينما سجل تحولا 3 يشير الخلايا الميتة ^4. حساب تحلل محددة من الخلايا عن طريق طرح نسبة من الخلايا الميتة في التحكم (PI٪ ^ارتفاع _CTL) من التجريبية (PI٪ _إكسب ^{عالية)،} على النحو التالي: تحلل محددة = (PI٪ _إكسب ^عالية -٪ PI ^عالية _CTL) / (100 -٪ PI ^عالية _CTL) * 100

4. Micropipette تسليم السمية إلى خلايا في أطباق الثقافة

1. قبل يوم واحد لتجربة لوحة الضامة، ⁵ 2X10 على الكولاجين المغلفة بالزجاج أسفل طبق 35 ملم.
2. بدوره على المجهر وmicroinjector. تسمح ساخنة لتدفئة الوقت المرحلة إلى 37 ° C. اختيار المجهر عادة ما يعتمد على ما هو متوفر محليا. المجهر المقلوب يحتاج إلى المرحلة، مرحلة قادرة على تسخين الأطباق إلى 37 ° C، مكعبات مرشح الإثارة / الانبعاثات المناسبة لاختيار الصبغة، والمساحة للاتصال جسديا microinjector. A برتراند عدسةهو مفيد للحقن مكروي، ولكن ليس مطلوبا. الكمبيوتر المجهر القيادة يحتاج ذاكرة كافية لجمع وتخزين البيانات.
3. الخلايا التسمية لمدة 30 دقيقة مع صبغة في 37 ° C. اعتمادا على الفحص، قد يتعين القيام به وضع العلامات مع 5 Fura2 ميكرولتر PBS مل صباحا في 1 أو 2 ميكرولتر AM calcein في وسائل الإعلام 1 مل كامل. لFura2، يتم جمع الإثارة / الانبعاثات ل340/510 نانومتر نانومتر و380/510، ونسبة 340/380 إشارات تحدد تدفق الكالسيوم. لcalcein، الإثارة / الانبعاثات هو 495/515 نانومتر بينما إيثيديوم homodimer هو 525/620 نانومتر وAPC هو 650/660 نانومتر. ويمكن اختيار تسميات أخرى أيضا.
4. تستكمل غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ومكان في 1 مل RPMI مع 2 مم CaCl _2. جبل على المجهر.
5. تخفيف السم وديكستران في الماء، وأجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة C. ° 4 عادة، يتم تخفيف SLO 1 ميكرولتر و 4 ميكرولتر 10 ملغ / مل ديكستران 555-في 6 ميكرولتر المياه. ويستخدم الفلورسنت ديكستران أو آخر جزيء السائل مراحل لتحقق من عدم انسداد فيمتو الطرف، وinjeسنت على النحو المرغوب فيه.
6. تحميل فيمتو معلومات من العمق مع 0،07 ميكرولتر من السم المخفف باستخدام microloader.
7. تحميل فيمتو على طرف microinjector. ضبط زاوية حاقن بحيث الطرف سيجلس على مركز للخلايا مع غرفة للتحرك في جميع الاتجاهات. مسح Z-الحد. وينبغي أن حقن حقن إعدادات ل0.5 ثانية عند 120 رطل لكل بوصة مربعة مع 20 PSI الضغط مرة أخرى. خفض تلميح إلى أن يدخل المتوسطة.
8. باستخدام عدسة برتراند، مركز الطرف واتبع نصيحة كما هو خفضت أقرب إلى الخلايا. مرة واحدة تفقد التركيز، يعود مرة أخرى الى البصريات الطبيعية. ينبغي أن يكون واضحا الظل الإبرة في الميدان. تركز فوق الخلايا وخفض الإبر فيه حتى في التركيز. التركيز مرة أخرى على الخلايا وتقديمهم بعناية الإبرة المتاخمة للخلية. تعيين الحد الأقصى لZ-الحقن. بدء التصوير، ونقل معلومات سرية إلى الموضع المطلوب، وضخ السم لاطلاق سراح في نقطة الوقت المطلوب. رفع الإبرة، والانتقال إلى منطقة جديدة من الخلايا وحقن. الانتقال إلى موقف إبرة الرئيسية لمنع أي غير مرغوب فيهاتسرب السم من الإبرة.

النتائج

يمكن عادة 10 ^{7 8} -10 يمكن الحصول عليها U / مل SLO مع تركيز البروتين من 4 ملغ / مل. كمية السم اللازمة لتحلل الخلايا تختلف وفقا لنوع الخلية، ولكن عادة ما يكون 125-500 U / مل SLO (الشكل 2B). يمكن أنواع الخلايا مثل الخلايا البلعمية تكون أكثر مقاومة (4000 U / مل) على الرغم من الآخر...

Discussion

وصف تقنيات تسمح هنا النظر في ردود الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. الخطوة الأكثر أهمية هو التعامل مع والجرعات من السم. يمكن أن يكون النشاط السم متغير للغاية، حتى بين مختلف مأخوذة من إعداد نفسه، بسبب هشاشتها. هذا يتطلب اختبار إما كل قسامة من السم ضد مرجع الخلية أو خط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
ني NTA الاغاروز	QIAGEN	30210
polymixin-الاغاروز	سيجما	P1411-5ML
زيبا Desalt سبين العقيد	الصياد	PI-89891
الأغنام كرات الدم الحمراء	الصياد	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	انظر المرجع 9
Cy5 صبغ monoreactive	GE للرعاية الصحية	PA25001
Fura2-AM	الحياة تكنولوجيز	F1221
Calcein AM / EThidium homodimer	الحياة تكنولوجيز	L3224
مكافحة CD11c-APC	BD العلوم البيولوجية	550261
الكولاجين المغلفة بالزجاج أسفل الطبق	ماتيك	P35GCol-1.5-10-C
فيمتو تلميح II	الصياد	E5242957000
Microloader	الصياد	E5242956003
ديكستران اليكسا 555	الحياة تكنولوجيز	D34679
Injectman NI 2	إيبندورف	920000029
FemtoJet	إيبندورف	5247 000.013
			الجدول 1. قائمة ومصدر الكواشف محددة و equipmحاجة الأنف والحنجرة. يتم سرد معدات معينة والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول، جنبا إلى جنب مع الشركة ورقم الكتالوج.
			3،1 العازلة تركيب الخطوة مستعملة ليز / اغسل 50 ملي ناه 2 ص 4 300 مم كلوريد الصوديوم 10 ملي إيميدازول، ودرجة الحموضة 8.0 1.4 تريس / الملح 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 مم كلوريد الصوديوم 1.7 شطف العازلة 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0 300 مم كلوريد الصوديوم 250 مم إيميدازول 1.8 RBC الفحص العازلة 0.3٪ BSA 2 مم CaCl 2 10 ملي HEPES، درجة الحموضة 7.4 2.1 العازلة R / B RPMI متوسطة خلية ثقافة 2 مم CaCl 2 0.5٪ BSA
			الجدول 2. قائمة مخازن المستخدمة في هذا البروتوكول. المخازن المؤقتة المستخدمة، يتم سرد تكوينها والخطوة الأولى التي يتم استخدامها في البروتوكول.