Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

Verfahren zur Reinigung des Cholesterins Bindung Toxin Streptolysin O aus rekombinanten E. coli Und Visualisierung von Toxin Bindung an eukaryotischen Zellen leben beschrieben. Lokalisierte Abgabe von Toxin induziert eine schnelle und komplexe Veränderungen in Zielzellen enthüllen neue Aspekte des Toxins Biologie.

Zusammenfassung

Bakterielle Toxine binden an Cholesterin in Membranen, Bildung von Poren, die auf Undichtigkeiten des Zellinhalts und Einströmen von Material von der äußeren Umgebung ermöglichen. Die Zelle kann entweder ins Insult, die Wirkmembran Reparaturprozesse erfordert wiederherzustellen, oder sterben abhängig von der Menge des Toxins Belichtung und ^ein Zelltyp. Darüber hinaus führen diese Toxine starke entzündliche Reaktionen in infizierten Wirten durch Aktivierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, die ein Array von pro-inflammatorischen Zytokinen ^{2 zu} erzeugen. Viele Gram-positive Bakterien produzieren Cholesterin bindenden Toxine, die gezeigt haben, um ihre Virulenz durch weitgehend charakterisierten Mechanismen beitragen.

Morphologischen Veränderungen in der Plasmamembran von Zellen, die diese Toxine umfassen ihre Sequestrierung in Cholesterin angereicherten Oberflächenprotrusionen, die in den extrazellulären Raum vergossen werden kann, was auf eine intrinsische zelluläre AbwehrMechanismus ^3,4. Dieser Vorgang geschieht für alle Zellen in Abwesenheit einer metabolischen Aktivität und visualisiert werden kann, nachdem mit EM chemischen Fixierung ^4. In Immunzellen wie Makrophagen, die Entzündung als Reaktion auf Exposition Toxin vermitteln, induziert werden Membranvesikel vorgeschlagen, Zytokine der IL-1-Familie enthalten und kann sowohl für vergießen Toxin und Weiterleitung dieser proinflammatorischen Zytokine ^5,6,7. Eine Verbindung zwischen IL-1β Freisetzung und einer bestimmten Art von Zelltod genannt hat pyroptosis vorgeschlagen worden, da beide Caspase-1-abhängiger Prozesse sind ^8. So sortieren Sie die Komplexität dieser Makrophagen Antwort, die Toxinbindung, vergießen Membranvesikel Zytokinfreisetzung und potenziell Zelltod enthält, haben wir die Kennzeichnung Techniken und Fluoreszenzmikroskopie Methoden, die für Echtzeit-Visualisierung von Toxin-Zell-Interaktionen ermöglichen, einschließlich entwickelt Messungen der Dysfunktion und Tod (Abbildung 1). Verwendendes Live Cell Imaging ist notwendig wegen der Beschränkungen in anderen Techniken. Biochemische Ansätze nicht lösen können auftretenden Effekte in einzelnen Zellen, während Durchflusszytometrie nicht bieten hohe Auflösung, Echtzeit-Visualisierung von einzelnen Zellen. Die hier beschriebenen Methoden können zur kinetischen Analyse der Antworten durch andere Reize mit komplexen phänotypischen Veränderungen in Zellen induziert aufgebracht werden.

Protokoll

Ein. Reinigung von Streptolysin O (SLO)

1. Beimpft 20 ml Übernacht-Kultur von BL21 GOLD Zellen mit pBADgIII-SLOhis Plasmid ⁹ in 0,5 L LB-Brühe und 500 ul 50 mg / ml Ampicillin. Schüttelkultur bei 225 UpM bei 37 ° C bis _OD600 = 0,6, in der Regel ~ 1,5 Stunden. Zentrifuge 1 ml Bakterien (als T ₀₎ bei 10.000 xg 5 min auflöst Pellet in 140 ul 1x SDS Probenpuffer / 1 OD und beschallen zu scheren DNA auf Proteinreinheit Analyse.
2. Bakterien induzieren unter Zusatz von 5 ml 20% Arabinose zu Kultur, bei 225 rpm bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt. Sammeln Sie 1 ml der Bakterien, zentrifugieren und lösen in 1x SDS Probenpuffer wie oben für T ₃ Zeitpunkt für Reinheit Analyse.
3. Sammle verbleibenden Bakterien in 500 ml Zentrifugenflasche, drehen 12.000 xg für 12 min bei 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3-Rotor). Den Überstand umfüllen, speichern Pellet bei -80 ° C über Nacht oder länger, falls erforderlich.
4. Resuspendieren frozen Pellet auf Eis in 10 ml Lyse / Waschpuffer (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) mit 400 ul 25% Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml Lysozym, 50 ergänzt ul 200 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Übertragen des resuspendierten Pellets in 50 ml Oak Ridge Röhre.
5. Beschallen Lysat 5 mal für 30 sec auf Eis mit 30 Sekunden-Intervallen. Spin beschallt Lysat in Oak Ridge Röhrchen bei 39.000 xg für 20 min bei 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34-Rotor).
6. Während das Lysat dreht, waschen 1 ml Ni-NTA-Agarose mit 10 ml Lyse / Waschpuffer und Spin bei 1.200 UpM für 5 min bei 4 ° C. (Alle weiteren Wäschen / Elutionen verwenden Zentrifugation unter diesen Bedingungen). Absaugen zu waschen.
7. Fügen bakterielle Überstand aus Schritt 1,5 bis Ni-NTA Agarose, schütteln für 2,5 h bei 4 ° C. Spin zu sammeln Überstand. Kombinieren Sie 30 ul Überstand mit 10 μ 4x SDS-Probenpuffer und sparen für Reinheit Analyse. Waschen Sie die Kugeln 4 Mal in Lyse / Waschpuffer undce in Tris / Salz-Puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluieren 3 mal durch Zugabe von 1 ml Elutionspuffer (250 mM Imidazol in Tris / Salzpuffer) und 5 ul 1 M Dithiothreit (DTT), um die Kügelchen, Inkubieren auf Eis für 10 min, dreht und Sammeln des Überstands. SLO ist ein sehr Redox-sensitive Protein, und muss auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden. Einmal verringert wurde, wird das Protein rasch verlieren, wenn seine Aktivität auf 37 ° C erwärmt, auch nur für kurze Zeit.
9. Waschen 500 ul Polymixin-konjugierte Agarose in Elutionspuffer, Spin bei 10.000 xg für 1 min bei 4 ° C und resuspendieren in 500 ul. Endotoxin führen, mit 200 ul Perlen jeder Elution und schütteln 4 ° C für 30 min. Spin bei 10.000 xg für 1 min bei 4 ° C, und speichern Sie den Überstand. Kombinieren Sie 30 ul jeder Elution mit 10 ul 4x SDS-Probenpuffer für die SDS-PAGE-Analyse.
10. Testen der Reinheit Elutionen durch SDS-PAGE. Kochen Sie die Proben für die Gel-Analyse bei 95 ° C gesichert für 5 min und Last 10 ul auf einem 10% Gel. Stain gel mit Coomassie zu visualisieren Proteins (Abbildung 2A). SLO ist 69 kDa. Durchführen einer Bradford Assay zur Proteinkonzentration zu bestimmen (typische Ausbeute beträgt 4 mg / ml für die ersten zwei Elutionen, sondern kann durch Bakterienstamm und Plasmid verwendet variieren).
11. Testen der hämolytischen Aktivität jedes Elution (siehe unten). Pool Elutionen wo Reinheit, Konzentration und hämolytische Aktivität zufriedenstellend sind. Aliquot SLO in Einweg-Aliquots (typischerweise 5-10 ul) auf Trockeneis und bei -80 ° C einfrieren

2. Hämolytische Assay

1. Waschen Schaf rote Blutkörperchen (Erythrozyten) in RBC Assay-Puffer (0,3% Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM CaCl _2, 10 mM Hepes, pH 7,4), Spin bei 1.200 UpM für 5 min und resuspendiert in 2,5% in RBCs 10 ml RBC Assay-Puffer.
2. Fügen Sie 10 ul RBC-Assay-Puffer / Well in 96-Well-V-Bodenplatte auf Eis. Serienmäßig verdünnen jeder Elution in zweifacher Ausfertigung. Typische Bereiche liegen Verdünnung 1:1.000 bis 1:512,000. Inklusive 3 Brunnen ohne Toxin und 3 Brunnen mit 10ul 2% Triton X-100 als minimal und maximal Vertiefungen sind.
3. Abdeckplatte und bei 37 ° C 30 min. Zentrifuge bei 1.200 rpm für 5 min. Übertragen 70 ul Überstand in einem flachen Boden 96 Well-Platte. Lesen A _405. Eine Einheit ist die Verdünnung des Toxins für 50% Lyse der Erythrozyten benötigt. Toxinaktivität ist 1 Einheit * Verdünnung factor/0.01 ml.

3. Zelle Lytic Assay

1. Ernten Sie die Zellen, count, Spin. Resuspendieren bei 2x10 ⁶ / ml in Puffer R / B (RPMI mit 2 mM CaCl _2, 0,5% BSA) und 20 ug / ml Propidiumiodid. Je 100 ul Zellen auf eine 96-Well-V-Bodenplatte.
2. Serienmäßig verdünnen SLO bis zur endgültigen Konzentration im Puffer R / B 2x, mit 100 ul Toxin oder 100 ul Puffer R / B-Zellen. Inkubieren 5 min 37 ° C. Typische Endkonzentrationen Bereich von 2000 U / ml bis 31,25 U / ml.
3. Führen Zellen auf Durchflusszytometer und sammeln Daten mit Filtern für Phycoerythrin (PE). A one-log Verschiebung stellt transient permeabilisiert cells während eine 3 log Verschiebung zeigt toten Zellen ^4. Berechnen Sie die spezifische Lyse der Zellen durch Subtrahieren der Prozentsatz an toten Zellen in der Kontrolle (% PI ^hohen _ctl) von der experimentellen (% PI ^hohen _exp), wie folgt: spezifische Lyse = (% PI ^hohen _exp -% PI ^hohen _ctl) / (100 -% PI ^hohen _ctl) * 100

4. Mikropipette Lieferung von Toxin zu Zellen in Kulturschalen

1. Einen Tag vor der Experiment Platte 2x10 ⁵ Makrophagen auf einem mit Kollagen beschichteten Glas-Boden 35 mm-Schale.
2. Schalten Mikroskop und Mikroinjektor. Erlauben Heiztisch Zeit auf 37 ° C erwärmen Die Wahl des Mikroskops in der Regel davon abhängt, was lokal verfügbar ist. Das Mikroskop braucht eine umgekehrte Stufe, eine Stufe der Lage Erhitzen der Speisen bis 37 ° C, Anregungs / Emissions Filterwürfel geeigneter für den Farbstoff gewählt, und der Raum den Anschluss der Mikroinjektorkopfs. A Bertrandlinseist hilfreich für die Mikroinjektion, aber nicht erforderlich. Der Computer Ansteuerung des Mikroskops muss ausreichend Speicher zu sammeln und zu speichern.
3. Etikett Zellen für 30 min mit Farbstoff bei 37 ° C. Je nach dem Assay kann Markierung mit 5 ul Fura2 Uhr in 1 ml PBS oder 2 ul Calcein AM in 1 ml vollständige Medien erfolgen. Für Fura2 wird Anregung / Emission für 340/510 nm und 380/510 nm gesammelt und das Verhältnis von 340/380 bestimmt, Signale Calciumflusses. Für Calcein ist Anregung / Emission 495/515 nm, während Ethidiumhomodimer ist 525/620 nm und APC ist 650/660 nm. Andere Etiketten können auch gewählt werden.
4. Waschen der Zellen mit PBS gewaschen und in 1 ml RPMI ergänzt mit 2 mM CaCl _2. Montieren Sie am Mikroskop.
5. Verdünnte Toxin und Dextran in Wasser und Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min 4 ° C Typischerweise wird 1 ul SLO und 4 ul 10 mg / ml Dextran-555 in 6 ul Wasser verdünnt. Dextran oder andere fluoreszierende Flüssigkeit-Phasen-Molekül wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Femto-Spitze nicht verstopft ist, und injects wie gewünscht.
6. Legen Femto-Tipp von hinten mit 0,07 ul der verdünnten Toxin mit einem Microloader.
7. Legen Femto-Spitze auf Mikroinjektor. Stellen Sie den Winkel der Injektor so, dass die Spitze sitzen über der Mitte der Zellen mit Raum in alle Richtungen bewegen. Löschen z-Grenze. Injection-Einstellungen sollten für 0,5 sec werden Injizieren bei 120 psi mit 20 psi Gegendruck. Untere Spitze, bis sie das Medium eintritt.
8. Verwenden des Bertrand-Linse, in der Mitte die Spitze und folgen der Spitze, wie es näher an den Zellen erniedrigt wird. Sobald Sie den Fokus verlieren, wechseln wieder zur normalen Optiken. Die Nadel Schatten sollte auf dem Gebiet offensichtlich. Konzentrieren Sie sich über den Zellen und Senken der Nadel bis es scharf ist. Der Fokus wieder auf die Zellen und sorgfältig bringen die Nadel benachbart zu einer Zelle. Stellen Sie die z-Limit für die Injektion. Commence Bildgebung, bewegen Spitze in die gewünschte Position, zu injizieren, um bei der gewünschten Toxin Zeitpunkt freizugeben. Heben Sie die Nadel, um eine neue Region von Zellen bewegen und zu injizieren. Nadel zur Ausgangsposition, um unerwünschte zu verhindernToxin Leckage von der Nadel.

Ergebnisse

Typischerweise 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO kann mit einer Proteinkonzentration von 4 mg / ml erzielt werden. Die Menge des Toxins zur Zelllyse benötigt je nach Zelltyp, aber üblicherweise 125 bis 500 U / ml SLO (2B). Zelltypen wie Makrophagen widerstandsfähiger (4000 U / ml), obwohl andere (vor allem T-Zelllinien) empfindlicher sind. Diese Sensitivitäten mit handelsüblichen SLO entsprechen. Toxinaktivität abnimmt etwa 2-fach mit jedem Frost-Tau, so hämolytischen Assays mit jeder C...

Diskussion

Die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die Untersuchung der Reaktionen von Immunzellen, um bakterielle Toxine. Der wichtigste Schritt ist die Handhabung und Dosierung des Toxins. Toxinaktivität kann äußerst variabel, sogar zwischen verschiedenen Aliquots derselben Zubereitung, aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit. Dies erfordert entweder eine Prüfung jedes einzelnen Aliquot des Toxins gegen eine Referenz Zelllinie oder RBCs oder mit Toxin Steigungen. Toxin Gradienten, wie Mikropipette geliefert, damit das gesamte ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Polymixin-Agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fischer	PI-89891
Schafe RBCs	Fischer	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	siehe Lit. 9
Cy5 monoreaktiven Farbstoff	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM / Ethidium Homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
Kollagen-beschichteten Glas-bottom Gericht	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
Femto-Tipp II	Fischer	E5242957000
Microloader	Fischer	E5242956003
Dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Tabelle 1. List und Quelle der spezifischen Reagenzien und Plaent benötigt. Besondere Geräte und Reagenzien in diesem Protokoll verwendet, zusammen mit Unternehmen und Katalog-Nummer aufgelistet.
			Puffer Zusammensetzung Schritt Lyse / Wash 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM Imidazol, pH 8,0 1,4 Tris / Salz 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 1,7 Elutionspuffer 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM Imidazol 1,8 RBC Assay-Puffer 0,3% BSA 2 mM CaCl 2 10 mM HEPES, pH 7,4 2,1 Puffer R / B Zellkulturmedium RPMI 2 mM CaCl 2 0,5% BSA 3,1
			Tabelle 2. Liste von Puffern in diesem Protokoll verwendet. Die verwendeten Puffer sind die Zusammensetzung und der erste Schritt bei der sie in dem Protokoll verwendet werden aufgelistet.