La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Resumen

Los métodos para purificar el colesterol unión toxina estreptolisina O de recombinante E. coli Y la visualización de la unión de la toxina a vivir las células eucariotas se describen. Entrega localizada de la toxina induce cambios rápidos y complejos en células específicas que revelan nuevos aspectos de la biología de la toxina.

Resumen

Las toxinas bacterianas se unen al colesterol en las membranas, la formación de poros que permiten la fuga del contenido celular y el flujo de los materiales desde el entorno externo. La célula o bien puede recuperarse de este insulto, que requiere procesos activos de reparación de la membrana, o morir en función de la cantidad de exposición a la toxina y tipo de célula ^1. Además, estas toxinas inducir fuertes respuestas inflamatorias en los huéspedes infectados a través de la activación de células inmunes, incluyendo los macrófagos, que producen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias ^2. Muchas bacterias Gram positivas producir colesterol toxinas vinculantes que se ha demostrado que contribuyen a su virulencia a través de mecanismos en gran medida no caracterizadas.

Cambios morfológicos en la membrana plasmática de las células expuestas a estas toxinas incluyen su secuestro en salientes superficiales enriquecidos en colesterol, que puede liberarse en el espacio extracelular, lo que sugiere una defensa celular intrínsecamecanismo de ^3,4. Este proceso se produce en todas las células en ausencia de actividad metabólica, y puede ser visualizado usando EM después de ⁴ fijación química. En las células inmunes, tales como macrófagos, que median la inflamación en respuesta a la exposición a la toxina, inducidos vesículas de membrana se sugieren para contener las citoquinas de la familia IL-1 y puede ser responsable tanto por derramar la toxina y la difusión de estas citoquinas pro-inflamatorias ^5,6,7. Un enlace entre la IL-1β de liberación y un tipo específico de la muerte celular, denominado pyroptosis ha sugerido, ya que ambos son procesos que dependen de la caspasa-1 ^8. Para resolver la complejidad de esta respuesta de los macrófagos, que incluye la unión toxina, el desprendimiento de las vesículas de membrana, la liberación de citoquinas, y la muerte potencialmente celular, se han desarrollado técnicas de etiquetado y los métodos de microscopía de fluorescencia que permiten la visualización en tiempo real de las interacciones célula-toxina, incluyendo mediciones de la disfunción y la muerte (Figura 1). Utilizarde imágenes de células vivas es necesario debido a las limitaciones en otras técnicas. Enfoques bioquímicos no puede resolver los efectos que ocurren en células individuales, mientras que la citometría de flujo no ofrece alta resolución, en tiempo real la visualización de células individuales. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a análisis de la cinética de las respuestas inducidas por otros estímulos que implican complejos cambios fenotípicos en las células.

Protocolo

1. Purificación de la estreptolisina O (SLO)

1. Inocular 20 ml de cultivo durante la noche de células BL21 oro que contenía el plásmido pBADgIII ^SLOhis-9 en caldo LB 0,5 L y añadir 500 l 50 mg / ml de ampicilina. Agitar cultivo a 225 rpm a 37 ° C hasta OD ₆₀₀ = 0,6, normalmente ~ 1,5 h. Centrifugar 1 ml de bacterias (considerados T ₀₎ a 10.000 xg 5 min, se disuelve el pellet en 140 l 1x tampón de muestra de SDS / OD 1 y sonicado para ADN de cizallamiento para el análisis de proteínas pureza.
2. Inducir bacterias con la adición de 5 ml de 20% de arabinosa a la cultura, agitar a 225 rpm a temperatura ambiente durante 3 h. Recoger 1 ml de las bacterias, se centrifuga y se disuelve en tampón de muestra de SDS 1x como anteriormente para el punto de tiempo T ₃ para el análisis de pureza.
3. Recoger las bacterias restantes en 500 ml botella de centrífuga, girar 12.000 xg durante 12 min a 4 ° C (8.500 rpm Sorvall rotor GS-3). Decantar el sobrenadante, tienda precipitado a -80 ° C durante la noche o más tiempo si es necesario.
4. Resuspender el frozen sedimento en hielo en 10 ml Lyse / Tampón de lavado (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) suplementado con 400 l 25% de Triton X-100, 100 l 100 mg / ml de lisozima, 50 l 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Transferir el precipitado resuspendido a 50 ml tubo Ridge, Oak.
5. Sonicar lisado 5 veces durante 30 segundos en hielo con intervalos de 30 seg. Centrifugación lisado sonicado en tubo Oak Ridge a 39.000 xg durante 20 min a 4 º C (18.000 rpm Sorvall rotor SS-34).
6. Mientras que el lisado está girando, lavar 1 ml de Ni-NTA agarosa con 10 ml Lyse / tampón de lavado y centrifugado a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. (Todos los lavados adicionales / eluciones utilizar centrifugación en estas condiciones). Aspirar lavar.
7. Añadir sobrenadante bacteriano procedente de la Etapa 1,5 a Ni-NTA agarosa, agitar suavemente durante 2,5 horas a 4 ° C. Girar para recoger el líquido sobrenadante. Combine 30 l de sobrenadante con 10 μ 4x SDS muestra de amortiguación y ahorrar para el análisis de pureza. Lavar las perlas 4 veces en Lyse / tampón de lavado y ence en Tris / sal tampón (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluir 3 veces mediante la adición de 1 ml de tampón de elución (250 mM de imidazol en tampón de Tris / tampón de sal) y 5 l 1 M de ditiotreitol (DTT) a perlas, incubando en hielo durante 10 min, centrifugado y recogiendo el sobrenadante. SLO es una proteína muy sensible a redox, y se debe mantener en hielo en todo momento. Una vez reducida, la proteína perderá rápidamente su actividad si se calienta a 37 ° C, incluso durante un corto período de tiempo.
9. Lavar 500 l polimixina-conjugado de agarosa en tampón de elución, centrifugado a 10.000 xg durante 1 min a 4 ° C y se resuspende en 500 l. Para agotar endotoxina, añadir 200 perlas mu l a cada elución y agitar 4 ° C durante 30 min. Centrifugado a 10.000 xg durante 1 min a 4 ° C, y guardar el sobrenadante. Combinar 30 l de cada elución con 10 l de 4x tampón de muestra de SDS para análisis SDS-PAGE.
10. Probar la pureza de eluciones por SDS-PAGE. Hervir muestras se guarda para análisis de gel a 95 º C durante 5 min y 10 l de carga en un gel de 10%. Mancha de gel con Coomassie para visualizar las proteínas (Figura 2A). SLO es 69 kDa. Realizar un ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína (rendimiento típico es de 4 mg / ml para dos eluciones primero, pero puede variar según la cepa bacteriana y del plásmido utilizado).
11. Prueba de la actividad hemolítica de cada elución (véase más adelante). Eluciones piscina donde la actividad de pureza, concentración y hemolítica son satisfactorios. SLO alícuota en un solo uso alícuotas (l típicamente 5-10), congela en hielo seco y se almacena a -80 ° C.

2. Ensayo hemolítico

1. Lavar glóbulos rojos de oveja (RBC) en RBC tampón de ensayo (0,3% albúmina de suero bovino (BSA), 2 mM CaCl _2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugado a 1.200 rpm durante 5 min y se resuspenden en 2,5% en los glóbulos rojos 10 ml de tampón de ensayo de RBC.
2. Añadir 10 l tampón de ensayo de RBC / pocillo en 96-y V-de la placa inferior en hielo. Diluciones seriadas cada elución por duplicado. Los rangos típicos de dilución son 1:1,000 a 1:512,000. Incluye 3 pozos con ninguna toxina y pozos 3 con 10l 2% de Triton X-100 como pozos mínimo y máximo, respectivamente.
3. Cubrir la placa e incubar a 37 ° C 30 min. Centrifugar a 1.200 rpm durante 5 min. Transferir 70 l de sobrenadante a una placa de fondo plano de 96 también. Lea A _405. Una unidad es la dilución de la toxina requerida para un 50% de lisis de los hematíes. Actividad de la toxina es de 1 unidad * dilución factor/0.01 ml.

3. Lítica celular Ensayo

1. Cosecha, recuento de células, spin. Resuspender en 2x10 ⁶ / ml en tampón de R / B (RPMI con 2 mM CaCl _2, 0,5% de BSA) y 20 ug / ml de yoduro de propidio. Añadir 100 células mu l a un 96-así fondo en V de la placa.
2. Diluir en serie SLO a 2x concentración final en tampón de R / B, añadir 100 l toxina o 100 l tampón de R / B a las células. Incubar 5 min 37 ° C. El rango típico concentraciones finales de 2.000 U / ml a 31,25 U / ml.
3. Ejecutar las células en citómetro de flujo y reunir datos con filtros para la ficoeritrina (PE). A cambio de un registro representa cel transitoriamente permeabilizadasls mientras que un cambio de log 3 indica las células muertas ^4. Cálculo de la lisis específica de las células restando el porcentaje de células muertas en el control (% PI ^alta _ctl) de la experimental (% _exp PI ^alta), como sigue: lisis específica = (% _exp PI ^alta -% PI ^alta _ctl) / (100 -% PI ^alta _ctl) * 100

4. Micropipetas de entrega de la toxina a las células en placas de cultivo

1. Un día antes del experimento, placa de 2x10 ⁵ macrófagos en un colágeno recubierto con fondo de cristal plato de 35 mm.
2. Encienda el microscopio y microinyector. Permitir tiempo de la etapa calentada a calentar a 37 ° C. La elección del microscopio por lo general depende de lo que está disponible localmente. El microscopio tiene una fase invertida, una etapa capaz de calentar los platos a 37 ° C, de excitación / emisión cubos de filtros apropiados para el colorante elegido, y el espacio para conectar físicamente el microinyector. Una lente de BertrandEs útil para la microinyección, pero no es obligatorio. El ordenador de conducción del microscopio necesita suficiente memoria para recoger y almacenar datos.
3. Marcar células durante 30 minutos con colorante a 37 º C. Dependiendo del ensayo, el etiquetado puede hacerse con 5 Fura2 AM mu l en 1 ml de PBS o 2 l de calceína AM en 1 ml de medio completo. Para Fura2, excitación / emisión es recogida para 340/510 nm y 380/510, y la relación de 340/380 señales determina el flujo de calcio. Para calceína, excitación / emisión es 495/515 nm, mientras que homodímero de etidio es de 525/620 nm y APC se encuentra a 650/660 nm. Otras etiquetas se pueden elegir también.
4. Lavar las células con PBS y el lugar en 1 ml de RPMI suplementado con 2 mM CaCl _2. Montar el microscopio.
5. Diluir la toxina y dextrano en agua, y se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min 4 º C. Típicamente, 1 l SLO y 4 l 10 mg / ml de dextrano 555-se diluye en 6 l de agua. Dextrano u otra molécula fluorescente en fase líquida se utiliza para verificar que la femto-punta no se ha obstruido, y Injects como se desee.
6. Carga de femto-punta por la parte posterior con 0,07 l de la toxina diluida con un microloader.
7. Carga de femto-punta en microinyector. Ajustar el ángulo de inyector de manera que la punta se sentará sobre el centro de las células con espacio para moverse en todas las direcciones. Borrar z-límite. Ajustes de inyección deben estar inyectando durante 0,5 segundos a 120 psi con una presión de 20 psi atrás. Baja punta hasta que entra en el medio.
8. Uso de la lente de Bertrand, el centro de la punta y el seguimiento de la punta a medida que desciende más cerca de las células. Una vez que se pierde el foco, vuelva a la óptica normal. La sombra aguja debería ser evidente en el campo. Enfoque por encima de las células y bajar la aguja hasta que esté en el foco. Centrarse de nuevo en las células y cuidadosamente llevar la aguja adyacente a una célula. Z Ajuste el límite de la inyección. Comenzar la imagen, mueva la punta a la posición deseada, inyectar a liberar toxinas en el punto de tiempo deseado. Levante la aguja, mueva a una nueva región de las células y se inyecta. Mueva la aguja a la posición inicial para evitar cualquier indeseadotoxina fuga de la aguja.

Resultados

Típicamente 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO puede obtenerse con una concentración de proteína de 4 mg / ml. La cantidad de toxina requerida para la lisis celular varía según el tipo de célula, pero generalmente es 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células como los macrófagos pueden ser más resistentes (4000 U / ml), aunque otros (especialmente líneas celulares T) son más sensibles. Estas sensibilidades corresponden con SLO disponible comercialmente. Actividad de la toxina d...

Discusión

Las técnicas aquí descritas permiten el examen de las respuestas de las células inmunes a las toxinas bacterianas. El paso más crítico es el manejo y la dosificación de la toxina. Actividad de la toxina puede ser muy variables, incluso entre diferentes alícuotas de la misma preparación, debido a su fragilidad. Esto requiere ya sea probando cada parte alícuota de toxina contra una línea celular de referencia o glóbulos rojos o el uso de gradientes de toxina. Gradientes de toxina, como entregado por micropipeta...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Ni-NTA agarosa	Qiagen	30210
polimixina-agarosa	Sigma	P1411-5ML
Zeba desalar spin columna	Pescador	PI-89891
Los glóbulos rojos de oveja	Pescador	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	ver nota 9
Cy5 tinte monorreactivo	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calceína AM / EThidium homodímero	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
colágeno recubierto con fondo de cristal plato	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Pescador	E5242957000
Microloader	Pescador	E5242956003
dextrano Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Tabla 1. Lista y fuente de los reactivos específicos y Equipment necesario. Equipos y reactivos utilizados en este protocolo, junto con la empresa y el número de catálogo se enumeran.
			Buffer Composición Paso Usado Lyse / Wash 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM de imidazol, pH 8,0 1,4 Tris / sal 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 1,7 Tampón de elución 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM de imidazol 1,8 RBC tampón de ensayo 0,3% de BSA 2 mM CaCl 2 10 mM HEPES, pH 7,4 2,1 tampón de R / B Células RPMI medio de cultivo 2 mM CaCl 2 0,5% de BSA 3,1
			Tabla 2. Lista de los tampones utilizados en este protocolo. Los tampones usados, su composición y el primer paso en el que se utilizan en el protocolo se enumeran.