Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Resumo

Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O recombinante E. coli E visualização de toxina se ligar a células eucarióticas vivo são descritos. Entrega localizada de toxina induz a mudanças rápidas e complexas em células-alvo, revelando novos aspectos da biologia toxina.

Resumo

Toxinas bacterianas ligar ao colesterol em membranas, formando poros que permitem o vazamento do conteúdo celular e influxo de materiais a partir do ambiente externo. A célula pode recuperar-se este insulto, o que requer processos de reparação activos de membrana, ou morrem, dependendo da quantidade de exposição a uma toxina e tipo de célula ^1. Além disso, estas toxinas induzir fortes respostas inflamatórias em hospedeiros infectados através da activação de células imunitárias, incluindo macrófagos, que produzem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias ^2. Muitas bactérias Gram-positivas produzem toxinas colesterol vinculativos que foram mostrados para contribuir para a sua virulência através de mecanismos largamente descaracterizados.

Alterações morfológicas na membrana plasmática das células expostas a estas toxinas incluem a sua sequestração em saliências colesterol enriquecidas de superfície, que podem ser derramadas para o espaço extracelular, sugerindo uma defesa celular intrínsecomecanismo de ^3,4. Este processo ocorre em todas as células na ausência de actividade metabólica, e pode ser visualizada usando EM após ⁴ a fixação química. Em células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, que medeiam a inflamação em resposta a exposição a uma toxina, vesículas de membrana induzidas são sugeridos para conter citocinas da família IL-1, e pode ser responsável tanto para o derramamento de toxinas e disseminação destas citoquinas pró-inflamatórias ^5,6,7. A ligação entre a IL-1β libertação e um tipo específico de morte celular, denominado pyroptosis tem sido sugerido, como ambos os processos são dependentes da caspase-1 ^8. Para resolver as complexidades desta resposta de macrófagos, que inclui a ligação da toxina, o derramamento de vesículas de membrana, a libertação de citoquinas, e da morte de células potencialmente, desenvolvemos técnicas de etiquetagem e de métodos de microscopia de fluorescência que permitem a visualização em tempo real da toxina de células-interacções, incluindo medidas de disfunção e morte (Figura 1). Usarde imagens de células vivas é necessária devido às limitações das outras técnicas. Abordagens bioquímicas não pode resolver os efeitos que ocorrem em células individuais, ao passo que a citometria de fluxo não oferece alta resolução, a visualização em tempo real das células individuais. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados a análise cinética de respostas induzidas por estímulos que envolvem complexos alterações fenotípicas em células.

Protocolo

1. Purificação de Estreptolisina O (SLO)

1. Inocular 20 mL de cultura durante a noite de células BL21 contendo ouro pBADgIII-SLOhis plasmídeo ⁹ em 0,5 L de caldo LB e adicionar 500 ul de 50 mg / ml de ampicilina. Agitar a cultura a 225 rpm a 37 ° C até _DO600 = 0,6, geralmente ~ 1,5 horas. Centrifugar 1 ml (bactérias consideradas T ₀₎ a 10.000 xg 5 min, dissolver o granulado em 140 ul de tampão de amostra SDS 1x / 1 OD e sonicar a DNA de cisalhamento para análise de pureza da proteína.
2. Induzir bactérias, com a adição de 5 ml de 20% de arabinose a cultura, agitar a 225 rpm à temperatura ambiente durante 3 hr. Colete 1 ml de cultura bacteriana, centrifugar e dissolver em 1x tampão de amostra de SDS como acima para T de tempo ₃ para análise de pureza.
3. Recolher as bactérias remanescentes no frasco de 500 ml de centrífuga, girar 12000 xg durante 12 min a 4 ° C (8.500 rpm rotor Sorvall GS-3). Decantar o sobrenadante, armazenar pelete a -80 ° C durante a noite ou mais tempo, se necessário.
4. Ressuspender o frozen pellet em gelo em 10 ml de Lise / O tampão de lavagem (50 mM de NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM de imidazole, pH 8,0) suplementado com 400 ul de 25% de Triton X-100, 100 uL de 100 mg / ml de lisozima, 50 200 ul mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Transferir o sedimento ressuspenso para tubo de 50 ml de Ridge Oak.
5. Sonicar lisado 5 vezes durante 30 segundos em gelo, com intervalos de 30 seg. Spin-lisado sonicado em carvalho cume tubo a 39.000 xg durante 20 min a 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor).
6. Enquanto o lisado está girando, lave 1 ml de Ni-NTA agarose com 10 ml de Lise / tampão de lavagem e centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. (Todas as lavagens adicionais / eluições utilizar a centrifugação sob estas condições). Aspirar lavar.
7. Adicionar sobrenadante bacteriano a partir do passo 1.5 a Ni-NTA agarose, agitar durante 2,5 horas a 4 ° C. Gire para recolher o sobrenadante. Combine 30 ul de sobrenadante com 10 tampão de amostra μ 4x SDS e salvar para análise de pureza. Lavar as pérolas 4 vezes em Lyse / tampão de lavagem e emce em Tris / sal tampão (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
8. Eluir 3 vezes por adição de 1 ml de tampão de eluição (250 mM de imidazole em Tris / tampão salino) e 5 ul de 1 M de ditiotreitol (DTT) a grânulos, incubação em gelo durante 10 min, centrifugação e recolhendo o sobrenadante. SLO é uma proteína muito sensível redox, e devem ser mantidos em gelo em todos os momentos. Uma vez reduzida, a proteína perderá rapidamente a sua actividade, se aquecido a 37 ° C, mesmo durante um curto período de tempo.
9. Lave 500 ul polimixina-conjugado de agarose em tampão de eluição, rotação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul. Para esgotar endotoxina, adicionar 200 ul de contas de cada eluição e agitar 4 ° C durante 30 min. Centrifugação a 10000 xg durante 1 min a 4 ° C, e guardar o sobrenadante. Combinar 30 ul de cada um de eluição com tampão de amostra de 10 ul 4x SDS para SDS-PAGE análise.
10. Testar a pureza de eluições por SDS-PAGE. Ferver as amostras guardadas para análise em gel a 95 ° C durante 5 min e 10 ul de carga sobre um gel a 10%. Mancha gel com Coomassie para visualizar proteína (Figura 2A). SLO é de 69 kDa. Executar um ensaio de Bradford para a determinação da concentração de proteína (rendimento típico é de 4 mg / ml para os primeiros dois eluições, mas pode variar de acordo com estirpe bacteriana e do plasmídeo utilizado).
11. Testar a actividade hemolítica de cada eluição (ver abaixo). Eluições piscina onde a atividade de concentração, pureza e hemolítica são satisfatórios. SLO alíquota em alíquotas de utilização única (ul tipicamente 5-10), em gelo seco congelar e armazenar a -80 ° C.

2. Ensaio hemolítico

1. Lavar glóbulos vermelhos de ovelha (RBC) em RBC tampão de ensaio (0,3% de albumina de soro bovino (BSA), 2 mM _de CaCl2, 10 mM de Hepes, pH 7,4), centrifugação a 1.200 rpm durante 5 min, e ressuspender em 2,5% em RBCs 10 ml de tampão de ensaio RBC.
2. Adicionar 10 ul de tampão de ensaio RBC / poço em placas de 96 poços de fundo em V de gelo. Série diluir cada eluição em duplicata. Gamas de diluição típicos são de 1:1.000 1:512,000. Incluem 3 poços sem toxina e 3 com 10 poçosul de Triton X-2% 100 como poços mínimo e máximo, respectivamente.
3. Cobrir a placa e incubar a 37 ° C 30 min. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 min. Transferir 70 uL de sobrenadante para uma placa de fundo plano de 96 poços. Leia A _405. Uma unidade é a diluição da toxina necessária para a lise de 50% dos glóbulos vermelhos. Atividade toxina é uma unidade * diluição factor/0.01 ml.

3. Ensaio de célula Lytic

1. Células de colheita, a contagem, spin. Ressuspender a 2x10 ⁶ / ml em tampão de R / B (RPMI com CaCl2 ₂ mM, BSA 0,5%) e 20 ug / ml de iodeto de propídio. Adicionar 100 ul de células de uma placa de 96 poços de fundo em V.
2. Seriadamente diluído SLO para 2x a concentração final em tampão de R / B, adicionar 100 ul de toxina ou 100 ul de tampão P / B às células. Incubar 5 min a 37 ° C. Gama típica de concentrações finais de 2,000 U / ml para 31,25 U / mL.
3. Executar células em citômetro de fluxo e recolher dados com filtros de ficoeritrina (PE). Uma mudança de um log-cel representa transitoriamente permeabilizadasls, enquanto um desvio de log 3 indica as células mortas ^4. Calcula-se a lise específica de células, subtraindo a percentagem de células mortas no controlo (% PI ^elevado _ctl) a partir da _(exp% PI ^elevado) experimental, como se segue: a lise específica = (% _exp PI ^elevado -% PI ^elevado _ctl) / (100 -% PI ^elevado _ctl) * 100

4. Micropipeta Entrega de Toxina de células em placas de cultura

1. Um dia antes da experiência, placa 2x10 ⁵ macrófagos em um colágeno revestido prato milímetros com fundo de vidro-35.
2. Ligue microscópio e microinjetor. Permitir tempo fase aquecida a aquecer até 37 ° C. A escolha do microscópio geralmente depende do que está localmente disponível. O microscópio de fase invertida precisa de uma, uma fase capaz de aquecer os pratos a 37 ° C, os cubos de excitação / emissão de filtro apropriadas para o corante escolhido, e o espaço de ligar fisicamente o microinjector. Uma lente Bertrandé útil para a micro-injecção, mas não exigida. O computador dirigir o microscópio precisa de memória suficiente para coletar e armazenar dados.
3. Células do rótulo para 30 min com corante, a 37 ° C. Dependendo do ensaio, etiquetagem pode ser feita com 5 uL Fura2 AM em 1 ml de PBS ou 2 ul de calceína AM em 1 ml de meio completo. Para Fura2, excitação / emissão é recolhida para 340/510 nm e 380/510 nm e a razão de 340/380 determina os sinais de fluxo de cálcio. Para calceína, excitação / emissão é 495/515 nm, enquanto etídio homodímero é 525/620 nm e APC é 650/660 nm. Outros rótulos podem ser escolhidos também.
4. Lavar as células com PBS e colocar em 1 ml de RPMI suplementado com 2 mM de CaCl _2. Montar em microscópio.
5. Diluir a toxina e o dextrano em água e centrifugar a 20000 xg durante 10 min 4 ° C. Tipicamente, uma SLO ul e 4 uL de 10 mg / ml de dextrano-555 é diluído em 6 ul de água. Dextrano ou outra molécula de fase fluida fluorescente é usado para verificar que o femto-ponta não estiver obstruído, e injects, como desejado.
6. Carregar femto ponta da parte traseira com 0,07 ul de toxina diluída utilizando uma microloader.
7. Carregar femto-ponta na microinjetor. Ajustar o ângulo do injector de modo a que a ponta se sentar sobre o centro das células, com espaço para se mover em todas as direções. Limpar z-limite. Configurações de injeção deve ser para injetar 0,5 segundos a 120 psi com pressão de 20 psi de volta. Diminuir ponta até que entra no meio.
8. Usando a lente Bertrand, centro da ponta e seguem a ponta, uma vez que é reduzida mais perto das células. Depois de perder o foco, voltar a ótica normais. A sombra da agulha deve ser aparente no campo. Concentre-se as células acima e abaixe a agulha até que esteja em foco. Concentre-se novamente as células e cuidadosamente trazer a agulha adjacente a uma célula. Definir o z-limite para a injeção. Iniciar imaging, mover a ponta para a posição desejada, injectar a libertar a toxina no ponto de tempo desejado. Levante a agulha, passar para uma nova região de células e injectar. Mover agulha para a posição inicial para evitar indesejadavazamento toxina da agulha.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Tipicamente 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO pode ser obtida com uma concentração de proteína de 4 mg / ml. A quantidade de toxina necessária para a lise das células varia com o tipo de célula, mas é geralmente 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células, como os macrófagos podem ser mais resistentes (4000 U / ml), embora outras linhas de células (especialmente T) são mais sensíveis. Estas sensibilidades corresponder com SLO comercialmente disponível. A actividade da toxina ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

As técnicas descritas aqui permitem a análise das respostas de células imunes para as toxinas bacterianas. A etapa mais crítica é o manuseamento e a dosagem da toxina. A actividade da toxina pode ser extremamente variável, mesmo entre diferentes alíquotas da mesma preparação, devido à sua fragilidade. Isto requer tanto o teste de cada aliquota de toxina contra uma linha de células de referência, ou RBCs ou utilizando gradientes de toxina. Gradientes de toxina, tal como entregue por micropipeta, permitir que ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polimixina-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba dessalinizar rotação col	Pescador	PI-89891
hemácias de ovinos	Pescador	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	ver ref 9
Cy5 corante monoreactive	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calceína AM / Ethidium homodímero	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
colágeno revestido prato fundo de vidro	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-ponta II	Pescador	E5242957000
Microloader	Pescador	E5242956003
dextrano Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Lista Tabela 1. Ea fonte de reagentes específicos e Equipent necessário. Equipamentos específicos e reagentes utilizados neste protocolo, juntamente com a empresa e número de catálogo estão listados.
			Tampão Composição Passo Usado Lyse / Wash 50 mM de NaH 2 PO 4 300 mM de NaCl Imidazole 10 mM, pH 8,0 1,4 Tris / sal 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl 1,7 Tampão de eluição 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM de NaCl Imidazole 250 mM 1,8 O tampão de ensaio RBC 0,3% de BSA 2 mM de CaCl 2 HEPES 10 mM, pH 7,4 2,1 tampão R / B Meio de cultura RPMI célula 2 mM de CaCl 2 BSA a 0,5% 3,1
			Lista Tabela 2. Dos buffers usados ​​neste protocolo. Os tampões utilizados, a sua composição e a primeira etapa em que são usados ​​no protocolo estão listadas.