Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Резюме

Методы очистки холестерина обязательного токсина стрептолизин O из рекомбинантных E. палочки И визуализации связывания токсинов жить эукариотических клеток описаны. Локализованные доставки токсин вызывает быстрые и сложные изменения в целевые клетки раскрывая новые аспекты токсина биологии.

Аннотация

Бактериальные токсины связываются с холестерином в мембране, образуя поры, которые позволяют утечка клеточного содержимого и притоком материалов из внешней среды. Клетка может либо выйти из этой оскорбление, которое требует активных процессов ремонта мембран, либо умирают в зависимости от количества воздействия токсинов и клетки ^1-го типа. Кроме того, эти токсины вызывают сильную воспалительную реакцию в зараженных хостов через активацию иммунных клеток, включая макрофаги, которые производят множество провоспалительных цитокинов ^2. Многие грамположительных бактерий производить холестерин обязательным токсины, которые, как было показано, способствует их вирулентность в значительной степени через неохарактеризованных механизмов.

Морфологические изменения в плазматической мембране клетки подвергаются воздействию этих токсинов включают их поглощение холестерина в обогащенной поверхности выступов, которые могут быть пролита в межклеточное пространство, что предполагает внутреннюю клеточную защитуМеханизм ^3,4. Этот процесс происходит во всех клетках в отсутствие метаболической активностью и могут быть визуализированы с помощью EM после химической ⁴ фиксации. В иммунных клеток, таких как макрофаги, которые опосредуют воспаление в ответ на воздействие токсинов, индуцированные мембранных везикул предложили, чтобы содержать цитокины IL-1 семья и может быть ответственность как за сброс токсинов и распространения этих провоспалительных цитокинов ^5,6,7. Связь между IL-1β выпуска и определенный тип гибели клеток, называемых pyroptosis была предложена, так как являются каспазы-1 зависимых процессов ^8. Чтобы разобраться в сложностях этого макрофагов ответ, который включает в себя токсины обязательным, упав на мембранных везикул, высвобождение цитокинов и, возможно, гибели клеток, мы разработали методы маркировки и флуоресцентной микроскопии, которые позволяют визуализации реального времени токсина межклеточных взаимодействий, в том числе Измерения дисфункции и смерти (рис. 1). Использоватьиз живых клеток необходимо в связи с ограничениями в других методов. Биохимические подходы не могут решить эффектов, происходящих в отдельных клетках, в то время проточной цитометрии не предлагает высокое разрешение, визуализации в реальном времени отдельных клеток. Методы, описанные здесь, могут быть применены к кинетического анализа ответов индуцированных другие стимулы включают в себя сложные фенотипические изменения в клетках.

протокол

1. Очистка стрептолизина O (SLO)

1. Инокулировать 20 мл ночной культуры BL21 ЗОЛОТО клеток, содержащих pBADgIII-SLOhis плазмиды ⁹ в 0,5 бульоне LB L и добавить 500 мкл 50 мг / мл ампициллина. Встряхнуть культуры на 225 оборотов в минуту при 37 ° С до OD ₆₀₀ = 0,6, как правило, ~ 1,5 часа. Центрифуга 1 мл бактерий (считается T ₀₎ при 10000 XG 5 мин, растворить осадок в 140 мкл 1x SDS буфера для образцов / 1 OD и разрушать ультразвуком сдвига ДНК для анализа белков чистоты.
2. Вызвать бактерий с добавлением 5 мл 20% арабинозы к культуре, трясти при 225 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 3 часов. Сбор 1 мл бактерий, центрифуги и раствориться в 1х буфере образца SDS, как указано выше для T _{3 раза} точкой для чистоты анализа.
3. Соберите оставшиеся бактерии в 500 мл бутылке центрифуги, спина 12000 х г в течение 12 мин при 4 ° С (8500 оборотов в минуту Sorvall GS-3 ротора). Слейте супернатант, магазин гранул при температуре -80 ° С в течение ночи или дольше, если необходимо.
4. Ресуспендируют птОзен гранул на льду в 10 мл Lyse / промывочного буфера (50 мМ NaH ₂ PO _4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8,0) дополнено с 400 мкл 25% Triton X-100, 100 мкл 100 мг / мл лизоцима, 50 мкл 200 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Передача Ресуспендированный осадок в 50 мл трубки Ок-Ридже.
5. Разрушать ультразвуком лизата 5 раз в течение 30 секунд на льду с 30-секундными интервалами. Спин ультразвуком лизат в трубке Ок-Ридж в 39000 х г в течение 20 мин при 4 ° C (18.000 оборотов в минуту Sorvall SS-34 ротор).
6. В то время как лизат спиннинг, мыть 1 мл Ni-NTA агарозы с 10 мл Lyse / промывочного буфера и спина на 1200 мин в течение 5 мин при 4 ° C. (Все дальнейшие моет / ELUTIONS использовать центрифугирования в этих условиях). Аспирируйте мыть.
7. Добавить бактериальной супернатант с шага от 1,5 до Ni-NTA агарозы, слегка встряхнуть в течение 2,5 ч при 4 ° C. Побочные собрать супернатант. Комбинат 30 мкл супернатанта с 10 μ 4x буфера для образцов SDS и сохранить для чистоты анализа. Вымойте бисером 4 раза в Lyse / промывочного буфера исе в Tris / соли буфера (50 мМ Трис, 300 мМ NaCl, рН 8,0).
8. Элюировать 3 раза добавлением 1 мл буфера элюции (250 мМ имидазола в Tris / соли буфера) и 5 ​​мкл 1 М ДТТ (DTT) в бисер, инкубации на льду в течение 10 мин, спиннинг и сбором супернатанта. SLO очень редокс-чувствительных белков, и должны быть на льду в любое время. Как только снижается, белок быстро теряют свою активность, если нагревали до 37 ° С, даже на короткий период времени.
9. Вымойте 500 мкл полимиксина-сопряженных агарозы в буфере элюирования, спина при 10000 х г в течение 1 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 500 мкл. Для разрушающих эндотоксин, добавить 200 мкл бисером каждого элюирования и встряхнуть 4 ° С в течение 30 мин. Спин при 10000 х г в течение 1 мин при 4 ° С, и сохраните супернатант. Комбинат 30 мкл каждого элюирования с 10 мкл образца 4x SDS буфера для SDS-PAGE анализа.
10. Проверьте чистоту элюирования на SDS-PAGE. Отварить образцы сохраняются для анализа гель при 95 ° С в течение 5 мин и нагрузке 10 мкл на 10% гель. Пятно GEл Кумасси визуализировать белки (рис. 2A). SLO составляет 69 кДа. Выполнение анализа Брэдфорда, чтобы определить концентрацию белка (типичный выход составляет 4 мг / мл в течение первых двух элюирования, но может варьироваться в зависимости от штамма бактерий и плазмид использовали).
11. Проверьте гемолитической активностью каждого элюирования (см. ниже). Бассейн элюирования, где чистоты, концентрации и гемолитической активностью являются удовлетворительными. Алиготе SLO в одноразовой порции (обычно 5-10 мкл), заморозить на сухом льду и хранят при температуре -80 ° C.

2. Гемолитическая анализа

1. Вымойте овец красных кровяных телец (эритроцитов) в РБК Аналитический буфер (0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 мМ CaCl _2, 10 мМ Hepes, рН 7,4), спина при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут, и ресуспендируют на 2,5% эритроцитов в 10 мл РБК буфере для анализа.
2. Добавить 10 мкл анализе РБК буфера / лунку в 96-луночные V-нижнюю пластину на льду. Серийно разбавления каждого элюирования в двух экземплярах. Типичный диапазон разбавления 1:1000 до 1:512,000. Включите 3 скважины, не токсин и 3 скважины по 10мкл 2% Triton X-100 как минимальное и максимальное скважин, соответственно.
3. Крышка и инкубировать при 37 ° С 30 мин. Центрифуга при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Передача 70 мкл супернатанта к плоским дном 96-луночный планшет. Прочитано _405. Один блок является разбавление токсинов требуется на 50% лизис эритроцитов. Токсин деятельности 1 шт * разбавления factor/0.01 мл.

3. Сотовые Литические анализа

1. Урожай клеток, граф, спина. Ресуспендируют на 2х10 ⁶ / мл в буфере R / B (RPMI с добавлением 2 мМ CaCl _2, 0,5% BSA) и 20 мкг / мл пропидия йодида. Добавить 100 мкл клеток в 96-и V-нижней пластине.
2. Поочередно разводить SLO в 2 раза конечной концентрации в буфере R / B, добавить 100 мкл токсина или 100 мкл буфера R / B в клетки. Инкубировать 5 мин 37 ° C. Типичные окончательного диапазона концентраций от 2.000 ед / мл до 31,25 Ед / мл.
3. Выполнить клеток на проточном цитометре и собирать данные с фильтрами для фикоэритрин (PE). Одного журнала сдвиг представляет временно пермеабилизованной челLs в то время как 3-журнал сдвиг указывает мертвых клеток ^4. Рассчитать специфического лизиса клеток путем вычитания доли мертвых клеток в контроле (% PI ^{высокой} _CTL) из экспериментальных (% PI ^{высокого} _опыта), а именно: специфического лизиса = (% PI ^{высокой} _ехр -% PI ^{высокой} _CTL) / (100 -% PI ^{высокой} _CTL) * 100

4. Микропипетки доставки токсинов в клетки в культуре посуды

1. За день до эксперимента, пластины 2x10 ⁵ макрофагов на коллагена покрытием со стеклянным дном 35 мм блюдо.
2. Включите микроскопа и микроинъектор. Позвольте с подогревом время этапа нагреваться до 37 ° С. Выбор микроскопа обычно зависит от того, что на местном рынке. Микроскоп необходимо перевернутой этапе, этапе могут нагревать блюда до 37 ° C, возбуждение / излучение светофильтров подходит для красителя выбрали, и пространства для физического подключения микроинъектор. Линзы Бертранаявляется полезным для микроинъекции, но не обязательно. Компьютер вождения микроскопа необходимо достаточно памяти для сбора и хранения данных.
3. Этикетка клетки в течение 30 мин с красителем при 37 ° C. В зависимости от анализа, маркировка может быть сделано с 5 мкл Fura2 утра в 1 мл PBS или 2 мкл кальцеин утра в 1 мл полной среды. Для Fura2, возбуждение / излучение, собранных для 340/510 нм и 380/510 нм, а отношение 340/380 сигналов определяет кальция потока. Для кальцеин, возбуждение / излучение 495/515 нм, в то время как этидия гомодимером является 525/620 нм и является APC 650/660 нм. Другие лейблы могут быть выбраны, как хорошо.
4. Вымойте клетки с PBS и место в 1 мл RPMI с добавлением 2 мМ CaCl _2. Монтируется на микроскопе.
5. Развести токсинов и декстрана в воде, и центрифуге при 20000 х г 10 мин в течение 4 ° C. Как правило, 1 мкл SLO и 4 мкл 10 мг / мл декстрана-555 разбавляют в 6 мкл воды. Декстран или другой жидкости флуоресцентный фазе молекулы используются для проверки того, что фемто-чаевые не засорен, и InjeCTS как хотелось бы.
6. Загрузите фемто-наконечник из заднего с 0,07 мкл разведенного токсина использованием microloader.
7. Загрузите фемто-наконечника на микроинъектор. Регулировка угла инжектора так, чтобы кончик будет сидеть по центру ячейки с номером, чтобы двигаться во всех направлениях. Очистить г-предел. Инъекции параметры должны быть инъекционных за 0,5 сек при 120 фунтов на квадратный дюйм с 20 обратного давления фунтов на квадратный дюйм. Нижний наконечник, пока он входит в среду.
8. Использование линза Бертрана, в центре кончика и следуйте чаевые, как опускается ближе к клеткам. Как только вы теряете фокус, вернуться к нормальной оптикой. Иглу тени должны быть очевидны в этой области. Фокус над клетками и опустить иглу, пока он находится в фокусе. Задний фокус на клетки и тщательно принести иглу, прилегающих к клетке. Установите г-лимит для инъекций. Начать изображения, переместите наконечник в нужное положение, вводят выпустить токсин в нужной точке времени. Поднимите иглу, переехать в новый регион клеток и инъекции. Перемещение иглы в исходное положение, чтобы предотвратить любые нежелательныеТоксин утечки из иглы.

Результаты

Обычно 10 ⁷ -10 ⁸ ед / мл SLO может быть получена с белком концентрации 4 мг / мл. Количество токсина необходимых для лизиса клеток меняется в зависимости от типа клеток, но, как правило, 125-500 ЕД / мл SLO (рис. 2В). Сотовый типов, таких как макрофаги могут быть более устойчивыми (400...

Обсуждение

Описанные здесь методы позволяют рассмотрении реакции иммунных клеток к бактериальным токсинам. Самым важным шагом является обработка и дозировки токсина. Токсин деятельности может быть чрезвычайно разнообразен, даже между различными аликвоты того же препарата, из-за его хрупкости. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Ni-NTA агарозы	Qiagen	30210
полимиксина-агарозы	Сигма	P1411-5мл
Zeba опреснения Спин коллег	Рыбак	PI-89891
овец эритроцитов	Рыбак	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	см. ссылку 9
Cy5 monoreactive красителя	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM / Ethidium гомодимером	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
коллагена покрытые прозрачным дном блюдо	Маттек	P35GCol-1.5-10-C
фемто-наконечник II	Рыбак	E5242957000
Microloader	Рыбак	E5242956003
декстран Alexa 555	Life Technologies	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Таблица 1. Список и источником специфических реагентов и ОснасткаЛОР необходимости. Специальное оборудование и реагенты, используемые в настоящем протоколе, вместе с компанией и каталожный номер в списке.
			Буфер Состав Шаг Б Lyse / Уош 50 мМ NaH 2 PO 4 300 мМ NaCl 10 мМ имидазола, рН 8,0 1,4 Tris / соли 50 мМ Трис, рН 8,0 300 мМ NaCl 1,7 Элюции буфером 50 мМ Трис, рН 8,0 300 мМ NaCl 250 мМ имидазола 1,8 РБК Аналитический буфер 0,3% BSA 2 мМ CaCl 2 10 мМ HEPES, рН 7,4 2,1 Буфер R / B RPMI культуре клеток среде 2 мМ CaCl 2 0,5% BSA 3,1
			Таблица 2. Список буферов, используемых в этом протоколе. Буферов, используемых, их состав и первым шагом на которых они используются в протоколе перечислены.