عالية الإنتاجية ELISA متسلسل للتأكد من صحة العلامات الحيوية من الأمراض الطعم ضد المضيف الحاد

Summary

لا يمكن أن يؤديها عالية مرت من التحقق من صحة المؤشرات الحيوية مرشح متعددة ELISA متتابعة من أجل تقليل تجميد / الذوبان دورات واستخدام عينات البلازما الثمينة. هنا، ونحن لشرح كيفية أداء بالتسلسل ELISAs لمدة ستة مختلف المؤشرات الحيوية البلازما التحقق من صحة ^1-3 من الطعم ضد المضيف المرض (GVHD) ⁴ على عينة البلازما نفسه.

Abstract

اكتشاف استراتيجيات منحازة البروتيوميات لديها القدرة على تحديد أعداد كبيرة من المؤشرات الحيوية التي يمكن أن تحسن رواية الاختبارات التشخيصية والنذير في عملية إعداد سريرية ويمكن أن تساعد التدخلات العلاجية دليل. عندما يتم تحديد أعداد كبيرة من البروتينات مرشح، قد يكون من الصعب التحقق من صحة المؤشرات الحيوية مرشح في الوقت المناسب والفعال من عينات البلازما التي هي الحدث المريض يحركها، من حجم محدود والتي لا يمكن تعويضها، مثل في بداية الحادة الطعم ضد المرض المضيف (GVHD)، من مضاعفات ربما تهدد حياتهم من خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT).

نحن هنا وصف عملية أداء ELISAs المتاحة تجاريا لبروتينات 6 التحقق من صحة GVHD: IL-2Rα ^5، TNFR1 ^6، HGF ^{7، IL-8} 8، elafin ^2، وREG3α ³ (المعروف أيضا باسم PAP1) بطريقة متسلسلة للحد من تجميد ذوبان الجليد دورات، وإذابة الوقت البلازما واستخدام البلازما. لهذا الإجراء ونحن أداء ELISAs في ترتيب تسلسلي على النحو الذي يحدده عامل تخفيف العينة على النحو المحدد في مختبرنا باستخدام مجموعات ELISA الصانع والبروتوكولات مع تعديلات طفيفة لتسهيل الأداء الأمثل ELISA متسلسلة. ويمكن بعد ذلك العلامات البيولوجية الناتجة تركيزات البلازما يتم تجميعها وتحليلها لنتائج هامة ضمن الفوج المريض. ولئن كانت هذه المؤشرات الحيوية حاليا لأغراض البحث فقط، ويعمل حاليا إدماجها في الرعاية السريرية يجري التحقيق في التجارب السريرية.

ويمكن تطبيق هذه التقنية على أداء ELISAs لبروتينات متعددة / السيتوكينات الفائدة على نفس العينة (ق) قدمت عينات لا تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع الكواشف الأخرى. يمكن إذا ELISA مجموعات لا تأتي مع لوحات ما قبل المغلفة، 96-وحات جيدة جيدا أو نصف لوحات 384 جيد أن تستخدم لتقليل استخدام مزيد من عينات / الكواشف.

Introduction

يتم قياس الحادة الطعم ضد المضيف المرض (GVHD)، وهو السبب الرئيسي للوفيات غير الانتكاس (إدارة الموارد الطبيعية) بعد خيفي زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCT)، عن طريق الخلل في أجهزة الجسم ثلاثة: الجلد والكبد والجهاز الهضمي (GI) المسالك ^4. GVHD الحادة يحدث عادة بين اثنين وثمانية أسابيع بعد زرع لكن قد تحدث في وقت لاحق، وغالبا ما يكون تمييزه سريريا من مضاعفات ما بعد HSCT أخرى مثل نظام تكييف سمية، والعدوى أو آثار جانبية للدواء. من خلال استخدام استراتيجيات البروتين والتحقق من صحة عالية الإنتاجية باستخدام ELISA متتابعة، وقد حددت لدينا 6 البروتينات التي تركيزات مرتفعة في بداية المظاهر السريرية للGVHD. يمكن تشخيص GVHD IL-2Rα، TNFR1، HGF و8-IL، عند دمجها في لوحة العلامات البيولوجية 4-في ظهور الأعراض السريرية ويمكن التنبؤ بعد HSCT بقاء بمعزل عن شدة GVHD ^1. Elafin، العلامات البيولوجية لGVHD من SKفي، يمكن التمييز بين الطفح الجلدي والطفح GVHD لأسباب أخرى مثل الانفجارات المخدرات والبقاء على قيد الحياة يمكن أن يتنبأ زرع ^2. حددنا مؤخرا REG3α والعلامات البيولوجية لGVHD من الجهاز الهضمي السفلي، الجهاز المستهدف الأكثر ارتباطا إدارة الموارد الطبيعية. يمكن تركيز البلازما REG3α تحديد موثوق GVHD كسبب لمرحلة ما بعد HSCT الإسهال وربط لشدة نسيجية من GVHD على الخزعات المعوية التشخيص. يمكن تركيزات REG3α في بداية GVHD GI التنبؤ أيضا الاستجابة للعلاج GVHD وإدارة الموارد الطبيعية ^3. حاليا إدماج هذه المؤشرات الحيوية في التحقق من صحة GVHD الرعاية السريرية يجري التحقيق في التجارب السريرية.

وأجريت هذه التجارب على البلازما مأخوذة الصغيرة التي تم جمعها من المرضى الذين يتلقون HSCT بين عامي 2000 و 2010 في وقت ظهور GVHD التي لا يمكن تعويضها والكمية محدودة. ونظرا لطبيعة هذه العينات الثمينة من، قمنا بتطوير الحدهود لقياس تركيزات بروتين البلازما متعددة بطريقة فعالة للقضاء على استنساخه الزائدة تجميد ذوبان الجليد دورات، واستخدام الوقت تحسن البلازما. ويمكن تطبيق هذه التقنية على أداء ELISAs لبروتينات متعددة / السيتوكينات الفائدة على نفس العينة (ق) قدمت عينات لا تحتاج إلى أن تكون مختلطة مع الكواشف الأخرى. يمكن إذا ELISA مجموعات لا تأتي مع لوحات ما قبل المغلفة، 96-وحات جيدة جيدا أو نصف لوحات 384 جيد أن تستخدم لتقليل استخدام مزيد من عينات / الكواشف. هذا المخطوط يركز على الجوانب التكنولوجية لقياس المؤشرات الحيوية GVHD.

Protocol

1. يوم تجربة 0: تحضير العينة واختبار ELISA طلاء اللوحة مع الأجسام المضادة للقطة IL-2Rα، وREG3α HGF

1. سوف يتم سحب عينات البلازما قسامة لتحليلها، ونسج في إذابة 12000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة للفصل بين جلطات في أسفل والدهون على أعلى من بلازما. سيتم مطلي 150 ميكرولتر من البلازما غير مخفف من كل عينة على لوحة أسفل V-96-جيدا (لوحة مصدر) من قبل pipetting دليل فقا لخرائط محددة مسبقا. وسيتم التفاف مأخوذة في parafilm ويحتفظ بها في غرفة الرطبة في C ° 4 خلال العملية برمتها؛ الموارد البشرية لم يعد من 72.
2. وسيعاد تشكيل IL-2Rα والأجسام المضادة التقاط HGF والمخفف للمواصفات الشركة المصنعة و 50 ميكرولتر سوف مطلي جيدا في كل من لوحات كل منها نصف جيدا جيدا 96-رفيع الملزمة التي هي مختومة ثم حضنت بين عشية وضحاها وعند 4 ° C. بدلا من ذلك، أن تجفف لوحات كثيرة في C ° 37 وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا، تعتمدجي على استقرار البروتين.
3. وسيتم تخفيفه REG3α الأجسام المضادة وفقا لبروتوكول القبض على منتج الشركة المصنعة باستخدام طلاء العازلة ميكرولتر و25 سوف يكون في كل مطلي جيدا لوحة ماكسي Sorp 384 جيد نونك التي اغلقت بعد ذلك وحضنت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

2. اليوم التجربة 1: IL-2Rα ELISA (الشكل 1)

1. يتم غسل لوحة الاختبار IL-2Rα، مع سد BLOTTO في TBS، وإعادة تشكيل القياسية ويتم إعداد منحنى القياسية 8-نقطة في بروتوكول الشركة المصنعة.
2. بعد الغسيل لوحة بعد خطوة حظر، ومطلي 50 ميكرولتر من البلازما غير مخفف من نسختين من لوحة إلى لوحة مصدر اختبار ELISA، ومطلي 50 ميكرولتر من كل معيار من نسختين. وختم لوحة وحضنت لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على محور دوار لوحة تعيين في 300 دورة في الدقيقة.
3. هو استخلاص البلازما من لوحة IL-2Rα اختبار ELISA وضعت مرة أخرى في الأمم المتحدةالمخفف لوحة البلازما المصدر. اكتمال ELISA في بروتوكول الصانع (مع وحدات التخزين لمدة نصف تعديلها بشكل جيد لوحات) والكثافة البصرية من كل بئر وسيتم قراءة باستخدام مجموعة قارئ لوحة ل450-570 نانومتر، والبيانات المحفوظة وتحليلها.

3. اليوم التجربة 1: REG3α ELISA (الشكل 1)

1. وسيتم نقل 10 ميكرولتر من البلازما غير مخفف لوحة منفصلة المصدر الخامس من الأسفل. يضاف 90 ميكرولتر من العازلة التي توفرها الشركة المصنعة لتخفيف كل بئر إلى إنشاء مصدر التخفيف 1:10 وحة.
2. يتم تنفيذ بروتوكول ELISA REG3α في المصنع (مع وحدات التخزين تعديل لوحات جيدة 384) وسيتم قراءة الكثافة الضوئية من كل بئر باستخدام قارئ لوحة لتعيين 450-620 نانومتر، وسيتم حفظ البيانات وتحليلها.

4. اليوم التجربة 1: Elafin وطلاء اللوحة TNFR1 اختبار الجسم المضاد مع التقاط

1. سوف Elafin والأجسام المضادة التقاط TNFR1 يعاد تشكيل وديلسوف uted في مواصفات الشركة المصنعة و 50 ميكرولتر مطلي جيدا في كل من لوحات كل منها نصف جيدا جيدا 96-رفيع الملزمة التي هي مختومة ثم حضنت بين عشية وضحاها وعلى درجة حرارة الغرفة لElafin، وعند 4 درجة مئوية لمدة TNFR1.

5. التجربة 1-2 يوم: HGF ELISA (الشكل 1)

1. بعد الانتهاء من IL-ELISA 2Rα وضمان الاختبار لا يحتاج إلى تكرار، وستخصص 60 ميكرولتر من البلازما غير مخفف نقلها إلى لوحة مصدر جديد ومن ثم يتم إضافة 60 ميكرولتر من 1٪ BSA في PBS X 1 إلى كل بئر لإجراء 01:02 مصدر البلازما المخفف لوحة.
2. يتم غسل لوحة الاختبار HGF، مع سد BLOTTO في TBS، وإعادة تشكيل القياسية ويتم إعداد منحنى القياسية 8-نقطة في بروتوكول الشركة المصنعة.
3. بعد الغسيل لوحة بعد خطوة حظر، ومطلي 50 ميكرولتر من البلازما 1:02 المخفف في تكرار الاختبار على لوحة ELISA، ومطلي 50 ميكرولتر من كل معيار من نسختين. وختم وحة وحضنت في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها على محور دوار لوحة تعيين في 300 دورة في الدقيقة.
4. هو استخلاص البلازما 1:02 المخفف من اختبار ELISA HGF وحة ووضعها مرة أخرى في 1:02 المخفف لوحة البلازما المصدر. اكتمال ELISA في بروتوكول الصانع (مع وحدات التخزين لمدة نصف تعديلها بشكل جيد لوحات) والكثافة البصرية من كل بئر وسيتم قراءة باستخدام مجموعة قارئ لوحة ل450-570 نانومتر، والبيانات المحفوظة وتحليلها.

6. يوم تجربة 2: Elafin ELISA

1. وسيتم نقل 10 ميكرولتر من البلازما غير مخفف لوحة مصدر جديد ومن ثم سيتم إضافة 190 ميكرولتر من 1٪ BSA في PBS X 1 إلى كل بئر لجعل 200 ميكرولتر من 1:20 البلازما dluted.
2. وELISA Elafin تنفيذ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (مع وحدات التخزين لمدة نصف تعديلها بشكل جيد لوحات)، والكثافة البصرية من كل بئر وسيتم قراءة باستخدام قارئ لوحة لتعيين 450-570 نانومتر، والبيانات المحفوظة وتحليلها.

7. التجربة داذ 2: TNFR1 ELISA

1. وسيتم إضافة 25 ميكرولتر من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني لوحة 1:20 المصدر (التي تحتوي على الآن 100 ميكرولتر من 1:20 البلازما) للحصول على 125 ميكرولتر من البلازما 1:25 المخفف.
2. اكتمال ELISA TNFR1 في بروتوكول الصانع (مع وحدات التخزين لمدة نصف تعديلها بشكل جيد لوحات) وسيتم قراءة الكثافة الضوئية من كل بئر باستخدام قارئ لوحة لتعيين 450-570 نانومتر، والبيانات المحفوظة وتحليلها.

8. يوم تجربة 2: IL-8 ELISA

1. وستخصص 60 ميكرولتر من البلازما 1:02 المخفف نقلها إلى لوحة مصدر جديد ثم يتم إضافة 180 ميكرولتر من 8-IL مخفف لكل بئر لإجراء 01:06 مصدر البلازما المخفف لوحة.
2. وIL-8 اكتمال ELISA في بروتوكول الصانع (مع وحدات التخزين لمدة نصف تعديلها بشكل جيد لوحات) وسيتم قراءة الكثافة الضوئية من كل بئر باستخدام قارئ لوحة لتعيين 450-570 نانومتر، والبيانات المحفوظة وتحليلها.

مرة واحدة وقد تم الانتهاء من جميع ELISAs، unuseسيتم استبدال المخزون د البلازما في إذابة ومأخوذة تجميد لاستخدامها في المستقبل.

النتائج

وترد تفاصيل سير العمل والجدول الزمني العلامات البيولوجية في الجدول 1 والجدول 2، على التوالي. الانتهاء مرة واحدة، وقد تم الآن تركيزات مختلفة من 6 البروتينات كميا على عينة البلازما نفسه باستخدام ما مجموعه 150 ميكرولتر من البلازما. تصفيح عينات من نسختين لكل اختبار يسمح لضمان الجودة الداخلية، مع السيرة الذاتية في أقل من 10٪ كونها الأمثل. إذا ELISA أداء متتابعة على لوحات متعددة، الكثافة الضوئية ثابت من مستوى عال ويفضل والسماح لموثوقية بين لوحة تحسين القياسات، ويمكن مقارنة مستوى منحنى المواد المستنفدة للأوزون بين لوحات للبحث عن تقييم الأداء في تناقض ELISA (الشكل 2). يتم سرد مرات التطوير باستخدام الركيزة اللونية tetramethylbenzidine وارتفاع تركيز المواد المستنفدة للأوزون لكل العلامات البيولوجية لوحظ في مختبرنا في الجدول 3.

tp_upload/4247/4247fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. سير العمل لIL-2Rα، وREG3α ELISAs HGF. بعد أن تم مطلي عينات البلازما على لوحات IL-2Rα اختبار ELISA هو استخلاص لجعل لوحات مصدر للتخفيف ELISAs أخرى. لELISA HGF، هو استخلاص البلازما لإعداد لوحة لتخفيف 01:06 IL-8. اضغط هنا لتكبير الرقم .

الشكل 2. كثافات الضوئية للمنحنى القياسية من 7 لوحات مختلفة ELISA قياس تركيزات REG3α المقابلة للمرضى 1084 اختبار للالتقرير الأولي GI REG3α العلامات البيولوجية GVHD ^3. المواد المستنفدة للأوزون لوحات متناسقة بين أؤكد متسقة قياسات تركيز البروتين بين لوحات. تركيزات البروتيناتفي البلازما يتم حساب عينات بمقارنة الكثافة الضوئية لعينة كثافة منحنى القياسية الضوئية.

يوم تجربة 0	1. إعداد عينات
	2. IL-2Rα، HGF وREG3α أب القبض
التجربة 1 يوم	1. IL-2RαELISA
	2. REG3αELISA
	3. HGF ELISA (من خلال طلاء العينة)
	4. Elafin وTNFR أب القبض
يوم 2 تجربة	1. HGF ELISA الانتهاء
	2. Elafin ELISA
	3. TNFR1 ELISA
	4. IL-8 ELISA
	5. غير المستخدمة اعادة تجميدبلازما

جدول العلامات البيولوجية GVHD 1. سير العمل نظرة عامة

اليوم 0		إعداد العينات وبين عشية وضحاها حضانة الجسم القبض
ELISA		IL-2Rα	REG3α	HGF	Elafin	TNFR1	IL-8
الوقت (ساعة)	0.0	حجب
	1.0	عينات مطلي
	3.0	استعادة عينات البلازما؛ الكشف عن أب	حجب؛ عينات تحضير (1:10 التخفيف)
	4.0		مطلي عينات (1:10)
	5.0	Streptavidin-HRP	الكشف عن أب
	5.5	TMB	Streptavidin-HRP
	ستة	لوحة القراءة	TMB	حجب؛ عينات تحضير (1:2 التخفيف)
	6.5		لوحة القراءة
	7.0			مطلي عينات (1:2)	القبض على أب (الحضانة بين عشية وضحاها)	القبض على أب (الحضانة بين عشية وضحاها)
يوم 2
الوقت (ساعة)	0.0			استعادة البلازما والاكتشاف أب	حجب؛ عينات تحضير (1:20)
	1.0				الطلاء عينة (1:2)	حجب؛ التخفيف مزيد من العينات لتخفيف 1:20 1:25
	2.0			HRP		الطلاء عينة (1:25)
	2.5			TMB
	3.0			لوحة القراءة	الكشف عن أب
	3.5						إعداد عينات (1:6 التخفيف)
	4.0					الكشف عن أب	الطلاء عينة (1:6)
	5.0				HRP
	5.5				TMB
	ستة				لوحة القراءة	HRP	الكشف عن أب
						TMB
	7.0					لوحة القراءة	TMB
	7.5						لوحة القراءة
بعد الانتهاء		استبدال البلازما المصدر إلى مأخوذة وتجميد لاستخدامها لاحقا

الجدول 2. الجدول الزمني لأداء ELISAs.

	البلازما التخفيف عامل	ستاندرد تركيز عال	الركيزة الوقت اللازم لتطوير (دقيقة)	ارتفاع OD	منحنى
IL-2Rα	01:01	2000 جزء من الغرام / مل	5	1	خطي
HGF	01:02	4000 جزء من الغرام / مل	22	2.1	4-المعلمة
IL-8	01:06	200 غ / مل	12	2.7	4-المعلمة
REG3α	1:10	100 نانوغرام / مل	12	1.7	4-المعلمة
Elafin	1:20	2000 جزء من الغرام / مل	20	1.9	4-المعلمة
TNFR1	1:25	800 جزء من الغرام / مل	8	2.7	خطي

الجدول 3. تفاصيل ELISA المؤشرات الحيوية لمدة 6 GVHD.

Discussion

طريقة ELISA متتابعة المقدمة هنا يسمح لقياس بروتينات البلازما متعددة على وحدات تخزين صغيرة من البلازما التي قد يكون من الصعب الحصول على و / أو التي لا يمكن تعويضها مثل عينات من البشر يعانون من أمراض نادرة أو عينات تم الحصول عليها من البلازما الفئران ^9،10. يتم تنفيذ عادة ELISAs متتابعة في ترتيب زيادة عامل تخفيف البلازما، مع ELISAs تتطلب البلازما المخفف ≥. 1:10 عادة لا تحتاج لاستخلاص، على الرغم من ويمكن أن يتم هذا إذا رغبت في ذلك ويقتصر القدرة على أداء ELISA ELISA متتابعة من قبل مجموعات / البروتوكولات التي يختلط البلازما مع الكواشف الأخرى أو التي تتطلب مخازن مختلفة لتخفيف البلازما، وهذا ما يحول دون ablility لعينة إعادة استخدام بسبب مخاوف من أن غير متوافق سوف العازلة / كاشف تتداخل مع أداء اختبار معين. مع التخطيط الدقيق، قد يتم تنفيذ 10 أو أكثر ELISAs على عينة البلازما نفسه.

قد الأنف والحنجرة "> مختبرات فردية تحتاج إلى ضبط التخفيفات البلازما من أجل الحصول على النتائج على أساس تفسير تركيزات البلازما من البروتين المتوقعة من الاهتمام في عينات من اختبار المواضيع. الاختلافات في المعدات المختبرية قد يؤدي إلى الحاجة إلى تحسين الحضانة والتنمية اللونية مرات، وعدد من يغسل و / أو غسل نقع مرة من أجل تحسين أي ELISA معين.

لزيادة القدرة الإنتاجية العالية والدقة وإجراء تحليلات بطريقة فعالة من حيث التكلفة، ويوصى باستخدام منصة تداول السائل الروبوتية قادرة على تحليل لوحات جيدا على 384 وغسالة لوحة الآلي مع وحدة التراص. يمكن هذا الجهاز زيادة دقة ودقة التحليل التي يقوم بها العديد من المستخدمين، وتساعد على توفير اتساق التحليل للحد من بين وداخل مقايسة الاختلاف.

كنا ELISA متتابعة على منصات متعددة متاحة لسببين: 1) معظميمكن للأزواج الأضداد البروتينات الرواية لا يكون من السهل على مترافق الخرز أو غيرها من المواد وكذلك مضيعة للوقت ومكلفة، 2) ELISA الفردية المقايسات أكثر دقة من ميكروأري متعددة أو الخرز، والثانوية لعدم وجود تفاعل المتبادل ^11. إذا ثبت وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتنفيذ المضاعفة، وحبة القائم على ميكروأرس، قد تكون قادرة على استبدال عملية ELISA متتابعة، ولكن قد تكون محدودة بسبب القدرة على الأجسام المضادة المتقارن لالخرز و / أو من قبل عدد من البروتينات المطلوبة لتكون تحليلها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
الإنسان IL-2 R ألفا Duoset	R & D أنظمة	DY223
الإنسان HGF Duoset	R & D أنظمة	DY294
الإنسان IL-8 II KIT OptEIA	بيكتون ديكنسون	550999
AB-ASSEMBLY المباراة الإنسان PAP1 (REG3α) كيت	MBL الدولية	5323
AB-UNIVERSAL المباراة كيت	MBL الدولية	5310
الإنسان sTNFRI/TNFRSF1A Duoset	R & D أنظمة	DY225
الإنسان Trappin-2/Elafin Duoset	R & D سيينبع	DY1747
96-وحات جيدة البوليسترين أسفل المخروطية	الحرارية العلمية	249570	تستخدم لوحات البلازما مصدر
COSTAR نصف علاوة على ارتفاع 96-ملزم وحات جيدة	كورنينج	3690	لIL-2Rα، HGF، وTNFR1 ELISAs elafin
نونك 384 وحات جيدة MaxiSorp	نونك	464718	لREG3α إليسا
التخزين المؤقت HyClone الفوسفات المالحة، 1X	الحرارية العلمية	SH30256.02
ألبومين المصل البقري، V الكسر، الصدمة الحرارية المعالجة	فيشر العلمية	BP1600-100
مانع BLOTTO في TBS	الحرارية العلمية	37530	منع وكيل لIL-2Rα HGF وELISAs TNFR1
Dulbecco فيالفوسفات مخزنة المالحة	Gibco	21600-069	غسل العازلة للIL-2Rα، HGF، وElafin ELISAs TNFR1
TMB بيروكسيد Susbtrate	Kirkegaard والمختبرات بيري	50-76-00
توين 20	العضوية أكروس	233362500	غسل العازلة للIL-2Rα، HGF، وElafin ELISAs TNFR1
حمض الكبريتيك	سيغما الدريخ	84720	(مخفف ل2N) لتوقف الحل