Высокая пропускная способность последовательного ELISA для проверки биомаркеров острого трансплантат против хозяина

Резюме

Высокая пропускная проверки нескольких биомаркеров кандидат может быть выполнена последовательная ELISA для того, чтобы свести к минимуму циклов замораживания / оттаивания и использования драгоценных образцов плазмы. Здесь мы покажем, как последовательно выполнять ИФА для шести различных подтверждено биомаркеров плазмы ^1-3 Трансплантат против хозяина (РТПХ) ⁴ На том же образце плазмы.

Аннотация

Объективные открытие протеомики стратегии есть потенциал, чтобы идентифицировать большое количество новых биомаркеров, которые могут улучшить результаты диагностики и тестирования в клинических условиях и может помочь руководство терапевтических вмешательств. Когда большое число кандидатов белков определены, это может быть трудным для проверки кандидатов биомаркеров в своевременном и эффективном моды от пациента образцы плазмы, которые событию, конечный объем и незаменимы, например, в начале острой трансплантат-против- хозяина (РТПХ), потенциально опасное для жизни осложнение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).

Здесь мы опишем процесс выполнения коммерчески доступных ИФА в течение шести подтверждено GVHD белков: IL-2Rα ^5, TNFR1 ^6, HGF ^{7, IL-8} 8, elafin ^2, и REG3α ³ (также известная как PAP1) в последовательном моды свести к минимуму циклов замораживания-оттаивания, Талые время плазмы и плазменные использования. Для этой процедуры мы проводим ИФА в последовательном порядке, как это определено образца коэффициент разбавления, установленный в нашей лаборатории с помощью ELISA производитель наборов и протоколов с незначительными изменениями для облегчения оптимального последовательного исполнения ELISA. В результате концентрация в плазме крови биомаркеров могут быть обобщены и проанализированы значительные результаты в когорте пациентов. Хотя эти биомаркеры в настоящее время только для исследовательских целей, их включение в медицинской помощи в настоящее время изучается в клинических испытаниях.

Этот метод может быть применен для выполнения ИФА для нескольких белков / цитокинов проценты по той же выборке (ы), при условии образцы не должны быть смешаны с другими реагентами. Если ИФА комплекты не поставляются с предварительно покрытых пластинами, 96-а полу-луночные планшеты или 384-луночных планшетов могут быть использованы для дальнейшей минимизации использования образцов / реагентов.

Введение

Острый трансплантат против хозяина (РТПХ), одной из ведущих причин, не рецидив смертности (NRM) после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), измеряется в трех дисфункции органов и систем: кожи, печени и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) тракта ^4. Острая РТПХ обычно происходит от двух до восьми недель после пересадки, но может произойти позже, и часто клинически неотличимые от других пост-ТГСК осложнений, таких как режим кондиционирования токсичности, инфекции или побочные эффекты лечения. Благодаря использованию протеомных стратегии и высокой пропускной проверку с помощью последовательного ELISA, мы определили 6 белков, концентрация которых повышена в начале клинических проявлений РТПХ. IL-2Rα, TNFR1, HGF и IL-8, когда объединены в 4-биомаркеров панели могут диагностировать РТПХ в начале клинических симптомов и может предсказать, после ТГСК выживания независимо от тяжести GVHD ^1. Elafin, биомаркеров для GVHD из SKВ, могут различать GVHD сыпь и высыпания от других причин, таких как наркотики извержений и не может предсказать выживания пересадки ^2. Недавно мы определили REG3α в качестве биомаркеров РТПХ нижнего желудочно-кишечного тракта, органов-мишеней всего связаны с природными ресурсами. Плазменные REG3α концентрации может надежно идентифицировать РТПХ в качестве причины для пост-ТГСК диарея и коррелируют с гистологической тяжести GVHD по диагностике кишечной биопсии. REG3α концентрации на начало GI GVHD также может предсказать реакции на трансплантат против хозяина терапии и NRM ^3. Включение этих подтверждено GVHD биомаркеров в клинической помощи в настоящее время изучается в клинических испытаниях.

Эти эксперименты проводились на небольшие аликвоты плазмы полученная от пациентов, получающих ГСК между 2000 и 2010 во время наступления GVHD, которые являются незаменимыми и ограниченном количестве. В связи с драгоценной природы этих образцов, мы разработали встретилисьХод измерения концентрации нескольких белков плазмы в эффективную, воспроизводимым способом ликвидации избыточных циклов замораживания-оттаивания, оттепель времени и плазменные использования. Этот метод может быть применен для выполнения ИФА для нескольких белков / цитокинов проценты по той же выборке (ы), при условии образцы не должны быть смешаны с другими реагентами. Если ИФА комплекты не поставляются с предварительно покрытых пластинами, 96-а полу-луночные планшеты или 384-луночных планшетов могут быть использованы для дальнейшей минимизации использования образцов / реагентов. Эта рукопись фокусируется на технологических аспектах измерения GVHD биомаркеров.

протокол

1. Эксперимент День 0: Подготовка проб и ИФА тест плиты покрытия с Capture антитела к IL-2Rα, REG3α и HGF

1. Плазменные аликвоты образцов для анализа будут выведены, оттаивают и центрифугируют при 12000 оборотов в минуту в течение 10 мин для отделения сгустков на дне и липидов на верхнем из плазмы. 150 мкл неразбавленного плазмы будут покрыты из каждого образца на 96-и V-нижняя пластина (источник пластины) ручной пипетки в соответствии с предопределенными карты. Аликвоты будут завернуты в парафильмом и держали во влажной камере при температуре 4 ° C в течение всего процесса; не более 72 часов.
2. IL-2Rα и антител HGF захвата будет преобразован и разбавляют согласно спецификации производителя, и 50 мкл будут покрыты в каждую лунку соответствующего 96-а высоких обязательного половину и пластин, которые затем закрывают и инкубируют в течение ночи при 4 ° C. Кроме того, многие плиты могут быть высушены при 37 ° С и хранят при 4 ° C для дальнейшего использования, зависитING на стабильность белка.
3. REG3α антител захвата будет разбавлять в зависимости от производителя протокол, используя производитель буферном покрытии и 25 мкл будет помещают в каждую лунку 384-а Nunc Maxi-SORP пластину, которая затем закрывают и инкубируют в течение ночи при 4 ° C.

2. Эксперимент День 1: IL-2Rα ELISA (рис. 1)

1. IL-2Rα испытательной пластины промывают, их с Blotto в TBS, и стандартный восстанавливается и 8-точки калибровочной кривой готовят на производителя протокол.
2. После промывания планшета после блокирования шагом 50 мкл неразбавленного плазмы покрытием в двух экземплярах от источника пластины к пластине ИФА, и 50 мкл каждого стандарта покрытием в двух экземплярах. Пластина запечатаны и выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре на тарелку ротатор установлен на 300 оборотов в минуту.
3. Плазма отвоеванной у Ил-2Rα пластины теста ELISA и помещен обратно в ООНразбавляют пластины источника плазмы. ELISA завершена на производителя протокол (с учетом объемов половины луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью набора пластин читателя 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.

3. Эксперимент День 1: REG3α ELISA (рис. 1)

1. 10 мкл неразбавленного плазмы будут переведены в отдельный V-дно источника пластины. 90 мкл производителя при условии разбавления буфера в каждую лунку добавляют для создания 1:10 пластины источника разведения.
2. REG3α ELISA осуществляется на производителя протокол (с поправкой на объемы 384-луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-620 нм, и данные будут сохранены и проанализированы.

4. Эксперимент День 1: Elafin и TNFR1 Тест плиты покрытия с Capture антител

1. Elafin и антител TNFR1 захвата будет воссоздана и разбавленнойраспределенными в соответствии со спецификацией производителя и 50 мкл будут покрыты в каждую лунку соответствующего 96-а высоких обязательного полу-луночные планшеты, которые затем закрывают и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре Elafin, а при 4 ° С в течение TNFR1.

5. Эксперимент День 1-2: HGF ELISA (рис. 1)

1. После завершения Ил-2Rα ELISA и обеспечения теста не нужно повторять по 60 мкл неразбавленного плазма будет передана в новую пластину источника, а затем 60 мкл 1% BSA в 1 х PBS добавляют в каждую лунку, чтобы 1:02 разбавленного пластины источника плазмы.
2. Пластина HGF теста промывают, их с Blotto в TBS, и стандартный восстанавливается и 8-точки калибровочной кривой готовят на производителя протокол.
3. После промывания планшета после блокировки шаг, 50 мкл разбавленного 1:2, плазма покрытием в двух экземплярах на тарелку ИФА, и 50 мкл каждого стандарта покрытием в двух экземплярах. Пластина запечатаны иинкубировали в течение ночи при комнатной температуре на тарелку ротатор установлен на 300 RPM.
4. 1:02 разбавленной плазмы будет освобожден от испытательной пластины HGF ИФА и помещен обратно в 1:02 разбавленного пластины источника плазмы. ELISA завершена на производителя протокол (с учетом объемов половины луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью набора пластин читателя 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.

6. Эксперимент День 2: Elafin ELISA

1. 10 мкл неразбавленного плазмы будут переведены на новую пластину источника, а затем 190 мкл 1% BSA в 1 х PBS будет добавлена ​​в каждую лунку, чтобы сделать 200 мкл плазмы dluted 1:20.
2. Elafin ELISA, как выполняется в соответствии с протоколом производителя (с учетом объемов полу-луночные планшеты), а оптическая плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.

7. Эксперимент DaУ 2: TNFR1 ELISA

1. 25 мкл 1% BSA в PBS будет добавлена ​​к пластине 1:20 источников (в настоящее время, содержащей 100 мкл плазмы 1:20), чтобы получить 125 мкл разбавленной 1:25 плазмы.
2. TNFR1 ELISA завершена на производителя протокол (с поправкой на объемы полу-луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.

8. Эксперимент День 2: IL-8 ELISA

1. 60 мкл разбавленного 1:2, плазма будет передана в новую пластину источника, а затем 180 мкл IL-8 разбавителя в каждую лунку добавляют, чтобы сделать разбавленный 1:06 пластины источника плазмы.
2. IL-8 ELISA завершена на производителя протокол (с поправкой на объемы полу-луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.

После того как все ИФА были завершены, unuseD складе плазмы будут заменены в талой аликвоты и замораживали для дальнейшего использования.

Результаты

Рабочий процесс биомаркеров и сроки, подробно изложены в таблицах 1 и 2, соответственно. После завершения концентрации 6 различных белков в настоящее время количественные на том же образце плазмы с помощью общей сложности 150 мкл плазмы. Покрывая образцов в двух экземплярах на тест позволяет для внутреннего контроля качества, с менее чем 10% CV в оптимальных. При выполнении последовательных ELISA на нескольких пластинах, в соответствии оптической плотности высокого уровня являются предпочтительными и обеспечить улучшение взаимодействия пластины надежность измерений; стандартной кривой ОР могут быть сопоставлены между пластинами, чтобы посмотреть оценки за непоследовательность в ИФА производительности (рис. 2). Развитие раз, используя тетраметилбензидина колориметрического субстрата и высокая концентрация наблюдается ОР для каждой биомаркеров в нашей лаборатории, приведены в таблице 3.

tp_upload/4247/4247fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Workflow для Ил-2Rα, REG3α и HGF ELISA. После того, как образцы плазмы были покрыты на Ил-2Rα пластин ИФА он будет утилизирован, чтобы сделать разведение пластин источником для других ELISA. Для HGF ELISA, плазма будет утилизирован подготовить 1:06 разбавление пластины для IL-8. Нажмите для увеличения рисунка .

Рисунок 2. Оптических плотностей для стандартной кривой 7 различных пластины ELISA измерения REG3α концентрациях, соответствующих 1084 обследованных пациентов на начальном REG3α GI GVHD биомаркеров доклада ^3. В соответствии ОРВ между пластинами обеспечения последовательного измерения концентрации белка между пластинами. Концентрации белкаВ образцах плазмы рассчитывается путем сравнения оптической плотности образца в стандартной кривой оптической плотности.

Эксперимент день 0	1. Подготовка образцов
	2. IL-2Rα, HGF и REG3α захвата Ab
Эксперимент День 1	1. IL-2RαELISA
	2. REG3αELISA
	3. HGF ИФА (через образец покрытия)
	4. Elafin и TNFR захвата Ab
Эксперимент 2-й день	1. HGF ELISA завершению
	2. Elafin ELISA
	3. TNFR1 ELISA
	4. IL-8 ELISA
	5. Заморозить неиспользованнуюплазма

Таблица 1. GVHD биомаркеров Workflow обзор

День 0		Подготовка проб и инкубации в течение ночи тело захвата
ELISA		IL-2Rα	REG3α	HGF	Elafin	TNFR1	IL-8
Время (ч)	0,0	Блокирование
	1,0	Образцы Металлизированное
	3,0	Возвращается образцы плазмы; обнаружения Ab	Блокировка; подготовки проб (1:10)
	4,0		Образцы покрытием (1:10)
	5,0	Стрептавидин-HRP	Обнаружение Ab
	5,5	TMB	Стрептавидин-HRP
	6,0	Плита чтения	TMB	Блокировка, подготовка образцов (1:2 разбавление)
	6,5		Плита чтения
	7,0			Образцы покрытием (1:2)	Захват Ab (инкубации в течение ночи)	Захват Ab (инкубации в течение ночи)
День 2
Время (ч)	0,0			Возвращается плазма, обнаружение Ab	Блокировка, подготовка образцов (1:20)
	1,0				Примеры покрытий (1:2)	Блокировка; Дальнейшее разбавление 1:20 до 1:25 образцы разбавления
	2,0			HRP		Примеры покрытий (1:25)
	2,5			TMB
	3,0			Плита чтения	Обнаружение Ab
	3,5						Подготовка образцов (1:6 разбавление)
	4,0					Обнаружение Ab	Примеры покрытий (1:6)
	5,0				HRP
	5,5				TMB
	6,0				Плита чтения	HRP	Обнаружение Ab
						TMB
	7,0					Плита чтения	TMB
	7,5						Плита чтении
После завершения		Заменить источник плазмы на аликвоты и заморозить для дальнейшего использования

Таблица 2. Сроки выполнения ИФА.

	Плазменные Коэффициент разведения	Высокий стандарт концентрации	Субстрат Развитие Время (мин)	Высокая OD	Кривая
IL-2Rα	1:01	2000 пг / мл	5	1	Линейный
HGF	1:02	4000 пг / мл	22	2,1	4-параметр
IL-8	1:06	200 пг / мл	12	2,7	4-параметр
REG3α	1:10	100 нг / мл	12	1,7	4-параметр
Elafin	1:20	2000 пг / мл	20	1,9	4-параметр
TNFR1	1:25	800 пг / мл	8	2,7	Линейный

Таблица 3. ELISA Подробности на 6 GVHD биомаркеров.

Обсуждение

Последовательный метод ИФА, представленные здесь позволяет производить измерения нескольких белков плазмы на малых объемах плазмы, которая может быть трудно получить и / или незаменимые, такие как образцы человеческих пациентов с редкими заболеваниями или плазму образцов, полученных от мышей ^9,10. Последовательное ИФА, как правило, осуществляется в порядке возрастания фактора разбавления плазмы, с ИФА требует плазме разбавленной ≥ 1:10 правило, не нуждаются в утилизирован, хотя это можно сделать при желании. Способность выполнять последовательные ELISA ограничен ИФА / протоколы, в которых плазма смешивается с другими реагентами или для которых разведение различных буферов, необходимых для плазмы; это исключает ablility повторно использовать образец из-за опасений, что несовместима Буфер / реагента будет вмешиваться в выполнение конкретного теста. При тщательном планировании, 10 или более ИФА может быть выполнена на том же образце плазмы.

ENT "> Индивидуальные лаборатории может потребоваться настроить плазмы разведения, чтобы иметь интерпретируемые результаты, основанные на ожидаемых концентрациях в плазме крови белка в образцах из испытуемых. Различия в лабораторном оборудовании может привести к необходимости оптимизации инкубации и колориметрических развития раза, количество промываний и / или мытья замочить раз для того, чтобы оптимизировать любой ELISA.

Для увеличения высокой пропускной способности и точности, и для выполнения анализов в экономически эффективным образом, использование роботов жидкость платформа обработки позволяет проводить анализ на 384-луночные планшеты и автоматизированная машина плита с укладки блока рекомендуется. Это оборудование может повысить достоверность и точность анализа, проведенного несколькими пользователями, и поможет обеспечить согласованность анализа для снижения меж-и внутри-анализ вариаций.

Мы использовали последовательное ELISA более доступные платформы мультиплексирования по двум причинам: 1) большинствоантитела пар для новых белков не может легко быть сопряжены с бисером или других материалов, а также трудоемким и дорогим, 2) отдельных ИФА являются более точными, чем микрочипов мультиплекс или бисером, вторичной по отношению к отсутствие перекрестной реактивности ^11. Если надежный метод создан для выполнения мультиплексированных, шарик на основе микрочипов, это может быть в состоянии заменить последовательный процесс ELISA, но может быть ограничена возможность сопряженные антитела к бисера и / или по количеству белков желал быть проанализированы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Человека IL-2 R альфа DuoSet	R & D Systems	DY223
HGF человека DuoSet	R & D Systems	DY294
Человека IL-8 OptEIA KIT II	Becton Dickinson	550999
Ab-Match АССАМБЛЕИ человека PAP1 (REG3α) Kit	MBL Международного	5323
Ab-Match универсальный комплект	MBL Международного	5310
Человека sTNFRI/TNFRSF1A DuoSet	R & D Systems	DY225
Человека Trappin-2/Elafin DuoSet	R & D Syстебли	DY1747
96-луночные полистирола конической нижней пластины	Thermo Scientific	249570	Используется для пластин источника плазмы
Costar половину и высокой обязательной 96-луночные	Гранулирование	3690	Для Ил-2Rα, HGF, TNFR1 и elafin ИФА
Nunc 384-а MaxiSorp пластин	Nunc	464718	Для REG3α Elisa
HyClone фосфатным буферным раствором, 1x	Thermo Scientific	SH30256.02
Бычьего сывороточного альбумина, доля V, Heat Shock Обработанная	Fisher Scientific	BP1600-100
Blocker Blotto в TBS	Thermo Scientific	37530	Блокирующий агент для Ил-2Rα HGF и TNFR1 ИФА
ДульбеккоФосфатно-солевой буфер	Gibco	21600-069	Промывочный буфер для Ил-2Rα, HGF, Elafin и TNFR1 ИФА
TMB Susbtrate Перекись	Kirkegaard и Perry Laboratories	50-76-00
Tween 20	Acros Organics	233362500	Промывочный буфер для Ил-2Rα, HGF, Elafin и TNFR1 ИФА
Серная кислота	Sigma-Aldrich	84720	(Разбавленный до 2N) для остановки решения