JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الموصوفة هنا هو في الجسم الحي التقنية لهياكل شبه الخلوية الصورة في حيوانات تعرضت لنقص الأكسجين باستخدام تدفق الغاز من خلال غرفة microincubation جنبا إلى جنب مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب واضح ومباشر ومرنة بما يكفي لتناسب مجموعة متنوعة من المعلمات التجريبية ونظم النموذج.

Abstract

وقد استخدم على نطاق واسع Caenorhabdits ايليجانس في دراسة مقاومة الإجهاد، والتي سهلت من الشفافية في مراحل الجنين والكبار فضلا عن توافر المسوخ الجينية والسلالات المحورة وراثيا معربا عن عدد لا يحصى من البروتينات الانصهار 1-4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عرض العمليات الحيوية مثل البروتينات انقسام الخلايا باستخدام مراسل fluorescently المسمى. ويمكن تيسير دراسة الانقسام من خلال استخدام الوقت الفاصل بين التجارب في مختلف النظم بما في ذلك الكائنات سليمة، وبالتالي في وقت مبكر C. هي مناسبة تماما ايليجانس الجنين لهذه الدراسة. المقدمة هنا هي تقنية التصوير التي في الجسم الحي الفرعية الخلوية الهياكل استجابة لنقص الأكسجين (99.999٪ N 2، <جزء في المليون 2 O 2) الإجهاد من الممكن استخدام تدفق الغاز من خلال الإعداد بسيطة على المجهر رفيع المستوى. يتم استخدام غرفة microincubation بالتزامن مع تدفق غاز النيتروجين من خلال المجهر والقرص الغزل مبائرلخلق بيئة تسيطر عليها فيه ولا يمكن تصوير الحيوانات في الجسم الحي. باستخدام GFP الموسومة تويولين جاما وهيستون، يمكن رصد ديناميات واعتقال انقسام الخلايا قبل وأثناء وبعد التعرض للبيئة الأوكسجين المحرومين. نتائج هذه التقنية هي عالية الدقة والفيديو والصور المفصلة للهياكل الخلايا خلال blastomeres الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين.

Protocol

1. تحضير العينة

  1. إنتاج أو الحصول على المناسبة المعدلة وراثيا C. ايليجانس سلالة من الفائدة المعدلة وراثيا باستخدام منهجيات أو من Caenorhabditis مركز علم الوراثة الأسهم (CGC) أو زميل. في هذه الحالة نستخدم سلالة TH32 (فطيرة-1-1 :: TBG :: GFP؛ فطيرة-1 :: GFP :: H2B) 5 لتصور الكروموسومات وcentrosomes كعلامات لانقسام الخلية.
  2. توليد عدد سكانها متزامنة باستخدام واحدة من ثلاث طرق: 1) تتفكك البالغين حامل في محلول هيبوكلوريت واستخدام الأجنة المتبقية 6، 2) اختيار أشخاص على حامل لوحة المصنف والسماح لهم وضع الأجنة لمدة 1-2 ساعة، أو 3) اختيار L4 اليرقات من السكان المختلطة والانتقال إلى لوحة المصنف الجديد.
  3. تنمو الديدان الخيطية في 20 ° C إلى مرحلة الشباب حامل، والتي سوف تأخذ ما يقرب من 96 ساعة من الفقس، 72 ساعة من اليرقات أو L1 24 ساعة تساقط L4 آخر. أجنة (2-20 خلية) في الرحم تحتوي على نواة كبيرة وblastomeres التي هي الأمثل لايماجالتغييرات جي الفرعية الخلوية وشبه النووية، على التوالي. هذه المنهجية توفر وسيلة لتوليد السكان البالغين الشباب التي تحتوي على وفرة عدد من الأجنة المبكرة.

2. تعيين إعداد الشرائح وغرفة نقص الأكسجين أعلى

  1. جعل غرفة الرطبة لعقد الشرائح المعدة من خلال وضع منشفة ورقية رطبة داخل طبق بتري كبير أو بن مغطاة غطاء حجم كاف.
  2. إعداد المنصهر الاغاروز 2٪ في O 2 H منزوع الأيونات عن طريق تسخين الخليط في الأواني الزجاجية عبر الميكروويف حمام أو ماء.
  3. وضع قطرات 1-3 من الاغاروز الحارة على شريحة زجاجية نظيفة المجهر. وضع على الفور الشريحة الثانية مقلوب عموديا على أعلى من انخفاض الاغاروز (ق)، واضغط قليلا حتى أن لوحة النتيجة سوف تكون رقيقة وخالية من فقاعات الهواء.
  4. إتاحة الوقت لتبرد ببطء بعيدا واتخاذ الشرائح المجهر 2 ترك لوحة الاغاروز سليمة على واحد من الشرائح. من المهم لضمان الاغاروز لوحة رقيقة بما يكفي لعدم interfeمع إعادة القدرة على التركيز المجهر في وقت لاحق. القدرة على تصور نموذج يعتمد أيضا على المسافة الضوئية المحددة للهدف الاستخدام، التي يمكن أن تختلف بين المجاهر.
  5. استخدام شفرة حلاقة نظيفة لتشكيل منصة الاغاروز في مربع صغير. تخزين في غرفة معدة للالرطبة حتى جاهزة للاستخدام.
  6. بعناية، وذلك باستخدام شفرة حلاقة نظيفة نفسه، اتخاذ حافة لوحة الاغاروز وتحويلها من الشريحة في الصعود إلى الدور ساترة 25 مم الدقيقة، وتجنب تراكم فقاعات الهواء تحت لوحة. وساترة الجولة المختارة لاستخدام بشكل مناسب في microincubator.
  7. إضافة قطرة من مخدر (0.5٪ tricaine، تتراميزول 0.05٪ في المخزن المؤقت M9) على منصة الاغاروز للاستخدام كمخدر. اختيار 5-10 والديدان مكان في قطرة من التخدير. تسمح دقيقة من 1-3 الديدان على وقف الحركة.
  8. الأساس المنطقي لمراقبة الأجنة داخل الرحم الكبار، بدلا من الأجنة تشريح، هو تقليل إمكانية desicca الجنيننشوئها والحركة بسبب تدفق غاز النيتروجين في جميع أنحاء الجنين.
  9. إضافة على الفور قطرة من النفط الهالوكربون على رأس الديدان لمنع الديدان من الجفاف كما هو تدفقت الغاز من خلال الغرفة. منذ النفط اللزج هو الهالوكربون يمكن للمرء استخدام الماصة أو تلميح غيض من دودة اختيار لجمع النفط وإسقاط على الديدان.
  10. وبمجرد أن ساترة دائرية تحتوي على الديدان مستعدة، أغلقت نصفي ليدن نضح يتم فصل microincubator، وساترة ومن ثم وضعت بعناية تستقيم على الحلبة أسفل. ثم يتم إغلاق الجانبين من الغرفة معا بإحكام.
  11. ثم يتم توصيل الدائرة إلى النيتروجين الصهريج لنقل الغاز عبر أنابيب بلاستيكية مرنة، ووضع في المكان المناسب على المسرح المجهر (الشكل 1C). وينبغي في هذا الوقت أن الأنبوب وmicroincubator التحقق بعناية لأي تسرب من خلال ضمان مرفق آمن للأنابيب وميناء من المقابس على طول الجانب من الغرفة. يمكن للمرء ALحتى انتشرت طفيفة كمية صغيرة من الماء والصابون على أنابيب للبحث عن الفقاعات، التي ستشكل إذا تسرب موجودا.

3. المجهر نقص الأكسجين في

  1. تحديد موقع في أقل الحيوانات التكبير، ثم الانتقال إلى أعلى ملائمة للتضخم (64x لهذا التطبيق) إلى الأنسجة أو الخلايا صورة ذات الأهمية مثل blastomeres الجنينية أو البويضات لدى البالغين. بدوره على الليزر نانومتر 488 إلى عرض GFP إشارة وتحديد موقع GFP البروتين الانصهار في الخلية (ق) من الفائدة.
  2. لتصور الاعتقال في مرحلة معينة من دورة الخلية القبض (على سبيل المثال الطور التمهيدي في وقت متأخر) تحديد قسيم أرومي في مرحلة سابقة من انقسام الخلايا (على سبيل المثال أو الطور البيني أواخر الطور التمهيدي في وقت مبكر). سوف علامات الخلوية مثل موقف مريكز، بدء التكثيف كروموسوم والموقع كروموسوم وجود أو عدم وجود الغلاف النووي تساعد في تحديد الخلية مرحلة دورة (الشكل 2A).
  3. وperfused ثم غرفة مع غاز النيتروجين (99.999٪N 2، <2 جزء في المليون O 2). في هذه الحالة نستخدم الضغط من 6 رطل، ولكن الضغط قد تحتاج إلى تعديل وتحسين اعتمادا على حجم كل microincubator وقطر الأنابيب في الاستخدام. يواصل رصد قسيم أرومي (ق) كما في النيتروجين يملأ الغرفة، وتعديل المستوى البؤري حسب الضرورة.
  4. في هذه المرحلة، بدأ الوقت الفاصل بين التصوير. ويجري التصوير لطالما كان ذلك ضروريا لالتقاط ظاهرة الاهتمام، في هذه الحالة القبض الطور التمهيدي والتحام الكروموسومات لغشاء النووية الداخلية. تؤخذ الصور مرة واحدة كل 10 ثانية لمدة لا تزيد مدة 30 دقيقة. ينبغي تعديل ترددات التقاط الصور والإعدادات مثل زيادة قوة الليزر وحسب الضرورة.
  5. يمكن في الوقت الذي الأجنة الاستجابة للبيئة تختلف تبعا لنقص الأكسجين مرحلة دورة الخلية عند التعرض نقص الأكسجين. عادة نقص الأكسجين الناجم عن إلقاء القبض الطور التمهيدي يحدث في غضون 20-30 دقيقة من بداية تدفق الغاز النيتروجين. وقد لاحظنا نقص الأكسجين الناجم عن اعتقال خلية دورة occurring في 20 دقيقة <. ويمكن الحصول على الصور خلال هذا الإطار الزمني، أو يمكن أن تكون معزولة في وقت لاحق صور معينة من الوقت الفاصل بين سلسلة. خيار آخر هو استخدام المجهر لتصور فيديو الفرعية الخلوية في هياكل الأجنة.
  6. لاسترداد المستند من الدولة التي يسببها نقص الأكسجين القبض، يتم تشغيل والغاز قبالة يسمح للغرفة للعودة إلى normoxia عن طريق الانتشار أثناء تسجيل الوقت الفاصل بين سلسلة. استئناف تقدم دورة الخلية وتنزيل لأكثر من الكروموسومات يحدث عادة في غضون 5-20 دقيقة من تحويل غاز النيتروجين من.
  7. لاحظ أنه في تجارب منفصلة وضعت مؤشرا نقص الأكسجين، ريسازورين، في التدفق من خلال microchamber، وقد تقرر أن يصبح نقص الأكسجين غرفة في المتوسط ​​ما يقرب من 19 دقيقة بعد النيتروجين تدفق الغاز قد بدأ.
  8. تتم معالجة الصور ومقاطع الفيديو باستخدام Imaris، J صورة فوتوشوب أو كويك تايم والمستوردة إلى للعرض.

النتائج

C. ايليجانس الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين الحاد (نقص الأكسجين) قادرة على البقاء على قيد الحياة من خلال اعتقال العمليات البيولوجية بما في ذلك تطوير وانقسام الخلايا 7. يمكن رصد اعتقال نقص الأكسجين الناجم عن انقسام الخلايا، على المستوى دون الخلوي، وذلك باستخد...

Discussion

الحرمان الأوكسجين ويعلق إحياء

على الرغم من أن التعرض للحرمان الأكسجين الحاد يمكن أن تكون قاتلة لبعض الكائنات الحية، بعض الكائنات الحية قادرة على البقاء على قيد الحياة التعرض لنقص الأكسجين. في حالة C. ايليجانس، بقاء التعرض نقص...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نعرب عن تقديرنا لالمدخلات والتعليقات من أعضاء مختبر باديلا. وقدمت سلالات النيماتودا في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). نعترف ونشكر الدكتور لون تيرنبول للمساعدة التقنية مع المجهري متحد البؤر. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF-IOS، والوظيفي) لPAP

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
الكواشف / معدات تركيب
هيبوكلوريت حل 0،7 ز KOH، 12 مل NaOCl 5٪، وجلب إلى 50 مل مع DDH 2 0
M9 العازلة 3 غ KH 2 PO 4 و 11 ز نا 2 HPO 4 و 5 ز كلوريد الصوديوم، 1 مل (1 M) MgSO 4 في 1 L O 2 DDH
الشرائح الزجاجية المجهر فيشر العلمية 12-550-343 3 "X1" x1.0 مم
جولة صغيرة ساترة علوم المجهر الإلكتروني 72223-01 25 مم القطر
الهالوكربون النفط 700 سيجما H8898-100ML
مخدر 0.5٪ tricصفحة Ain، تتراميزول 0.05٪
ليدن مغلق الإرواء Microincubator جهاز هارفارد 650041
UHP النيتروجين Calgaz (إير ليكيد) > 99،9990٪ N 2 <2 O 2 جزء في المليون
البلاستيك أنابيب VWR 89068-468 0،062 "ID X 0.125" OD
مجهر متحد البؤر القرص الغزل نظم McBain زايس البصرية مقلوب المجهر، ونظام الإضاءة epifluorescence، CSU-10 الماسح الضوئي مبائر يوكوجاوا، هاماماتسو كاميرا CCD الإلكترون مضاعف.

References

  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
  3. Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
  4. Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
  5. Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
  6. Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
  7. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  8. Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
  9. Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
  10. Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
  11. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  12. Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
  13. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  14. Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

70 C Caenorhabdits

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved