L&#39;uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni

Riepilogo

Qui descritto è un In vivo Tecnica di immagine strutture subcellulari in animali esposti ad anossia utilizzando un flusso di gas attraverso la camera microincubation in congiunzione con un microscopio confocale disco rotante. Questo metodo è semplice e flessibile abbastanza per soddisfare una varietà di parametri sperimentali e sistemi modello.

Abstract

Elegans Caenorhabdits è stato ampiamente utilizzato nello studio della resistenza alle sollecitazioni, che è facilitato dalla trasparenza degli stadi adulti ed embrioni nonché dalla disponibilità di mutanti genetici e ceppi transgenici che esprimono una miriade di proteine ​​di fusione ^1-4. Inoltre, i processi dinamici come la divisione cellulare può essere visualizzato utilizzando proteine ​​del reporter fluorescente etichettati. Lo studio della mitosi può essere facilitata attraverso l'utilizzo di time-lapse esperimenti in vari sistemi, compresi gli organismi intatti e di conseguenza l'inizio C. embrione elegans è adatto per questo studio. Presentato qui è una tecnica con la quale immagini in vivo di strutture subcellulari in risposta a anossica (99.999% N _2; <2 ppm O ₂₎ lo stress è possibile con un semplice flusso di gas attraverso la configurazione di un potente microscopio. Una camera microincubation viene utilizzato in combinazione con un flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotanteper creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in vivo. Utilizzando GFP-tubulina gamma etichettato e istoni, la dinamica e arresto della divisione cellulare può essere monitorato prima, durante e dopo l'esposizione ad un ambiente privo di ossigeno. I risultati di questa tecnica sono ad alta risoluzione, video e immagini dettagliate delle strutture cellulari all'interno blastomeri di embrioni esposti a deprivazione di ossigeno.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Produrre o ottenere adeguata transgenici C. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche o da Caenorhabditis Genetica Image Center (CGC) o un collega. In questo caso stiamo usando ceppo TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) ⁵ per visualizzare i cromosomi e centrosomi come marcatori per la divisione cellulare.
2. Genera una popolazione sincronizzato utilizzando uno dei tre metodi: 1) si disintegrano adulti gravide in soluzione di ipoclorito e utilizzare gli embrioni restanti ^6, 2) raccogliere adulti gravide su un piatto semi e farli posare embrioni per 1-2 ore, o 3) raccogliere L4 larve da una popolazione mista e passaggio ad una nuova piastra testa di serie.
3. Grow nematodi a 20 ° C fino all'età adulta gravido giovani, che avrà circa 96 ore dalla schiusa, 72 ore da larve L1 o 24 ore dopo molt L4. Gli embrioni (2-20 celle) in utero contengono blastomeri grandi e nuclei che sono ottimali per imagmodifiche zione sub-cellulari e sub-nucleare, rispettivamente. Questo metodo fornisce un mezzo per generare una popolazione di giovani adulti che contengono un numero abbondante di embrioni precoci.

2. Preparazione Far scorrere e anossia Camera Set Up

1. Effettuare una camera umida per contenere vetrini preparati mettendo un tovagliolo di carta umido all'interno di un grande piatto Petri o contenitore coperto con un coperchio di dimensioni sufficienti.
2. Preparare fuso agarosio al 2% in acqua deionizzata H ₂ O per riscaldamento composto in vetro con bagno forno a microonde o in acqua.
3. Mettere 1-3 gocce di caldo agarosio su un vetrino da microscopio pulito di vetro. Porre immediatamente una seconda slitta invertito perpendicolarmente sulla cima della goccia agarosio (s), premere leggermente in modo che la pastiglia risultante sarà sottile e privo di bolle d'aria.
4. Attendere che si raffreddi e lentamente smontare i due vetrini che lasciano intatto il pad agarosio su una delle diapositive. È importante assicurare il pad agarosio è sufficientemente sottile da non interfenuovamente con la capacità di concentrare il microscopio tardi. Capacità di visualizzare campione dipende anche la distanza ottica specifica dell'obiettivo in uso, che può variare tra microscopi.
5. Utilizzare una lama di rasoio pulito per modellare pad agarosio in una piccola piazza. Memorizzare nella camera umida preparata fino al momento dell'uso.
6. Accuratamente, utilizzando la stessa lama di rasoio pulito, prendere il bordo del pad agarosio e trasferirlo dal vetrino su un tondo 25 millimetri micro coprioggetti, evitando l'accumulo di bolle d'aria sotto il pad. Il copri tutto selezionato da utilizzare si inserisce in modo appropriato nella microincubator.
7. Aggiungere una goccia di anestetico (0,5% tricaine, 0,05% in Tetramisole M9 buffer) sul pad agarosio per uso come anestetico. Scegli vermi 5-10 e posto nella goccia di anestetico. Lasciare 1-3 min per i vermi a cessare il movimento.
8. Il razionale per osservare embrioni all'interno dell'utero adulto, invece di embrioni sezionato, è ridurre al minimo il potenziale di embrione desiccazione e movimento a causa del flusso di gas di azoto attraverso l'embrione.
9. Immediatamente aggiungere una goccia di olio Halocarbon sopra i vermi per evitare che i vermi di disidratazione il gas viene fatto fluire attraverso la camera. Dal momento che l'olio è viscoso Halocarbon si può usare una punta della pipetta o la punta di una vite senza fine sceglie di raccogliere l'olio e caduta sui vermi.
10. Una volta che il coverglass circolare contenente i vermi è pronto, le due metà del Leiden chiuso perfusione microincubator sono separati, e poi attentamente coverglass è posto verticalmente sull'anello inferiore. I due lati della camera vengono poi chiusi ermeticamente insieme.
11. La camera è quindi collegato al serbatoio del gas azoto attraverso tubi di plastica flessibile e collocato nel punto appropriato sulla scena microscopio (Figura 1C). In questo momento il tubo e microincubator devono essere attentamente controllati per eventuali perdite assicurando il fissaggio sicuro dei tubi e dei tappi lungo il lato della camera. Si può alcon tanta leggerezza diffondere una piccola quantità di acqua e sapone sul tubo alla ricerca di bolle, che andranno a formare, se è presente una perdita.

3. Microscopia in anossia

1. Individuare gli animali a basso ingrandimento, poi, passare al più alto ingrandimento appropriato (64x per questa applicazione) ai tessuti immagine o le cellule di interesse come blastomeri embrionali o ovociti negli adulti. Accendere il laser 488 nm per visualizzare il segnale GFP e proteina di fusione GFP individuare nella cella (s) di interesse.
2. Per visualizzare l'arresto al determinata fase di arresto del ciclo cellulare (ad es profase tardi) identificano un blastomero in una fase preliminare di divisione cellulare (ad es interfase in ritardo o profase precoce). Marcatori cellulari, come la posizione centriolo, avvio della condensazione cromosomica, la posizione dei cromosomi e la presenza o l'assenza della busta nucleare permetterà di individuare fasi del ciclo cellulare (Figura 2A).
3. La camera viene poi perfusi con gas azoto (99,999%N _2; <2 ppm O _2). In questo caso si utilizza una pressione di 6 psi, tuttavia la pressione può essere necessario regolare e ottimizzato a seconda della dimensione di ciascun microincubator e diametro del tubo in uso. Continuare a monitorare la blastomero (s) come azoto riempie la camera, la regolazione del piano focale come necessario.
4. A questo punto, time-lapse imaging è iniziata. Imaging è condotto per il tempo necessario per catturare fenomeno di interesse, in questo caso e arresto profase aggancio dei cromosomi alla membrana interna nucleare. Le immagini sono presi una volta ogni 10 secondi per non più di 30 min. Le frequenze di cattura di immagini e impostazioni quali il guadagno e la potenza del laser deve essere regolato secondo necessità.
5. Il tempo in cui gli embrioni rispondere all'ambiente anossico può variare a seconda dello stadio del ciclo cellulare in seguito all'esposizione anossia. Tipicamente anossia arresto indotto profase si verifica entro 20-30 minuti di inizio flusso di gas di azoto. Abbiamo osservato anossia-indotta del ciclo cellulare occu arrestoRing in <20 min. Le immagini possono essere ottenute durante questo lasso di tempo, o le immagini fisse possono essere isolati in seguito da un time-lapse serie. Un'ulteriore opzione è quella di utilizzare la microscopia video per visualizzare strutture subcellulari in embrioni.
6. Per documentare recupero dalla anossia indotto stato arrestato, il gas viene spento e la camera viene permesso di tornare normossia per diffusione durante la registrazione di un time-lapse serie. Ripresa della progressione del ciclo cellulare e lo scollegamento dei cromosomi si verifica in genere entro 5-20 minuti di trasformare l'azoto off.
7. Si noti che in esperimenti separati un indicatore anossia, resazurina, è stato posto in flusso continuo microcamera, è stato determinato che la camera diventa anossica in media di circa 19 min dopo il flusso del gas di azoto è iniziata.
8. Le immagini ei video sono trattati con Imaris, Immagine a J o Photoshop e importati in QuickTime per la visualizzazione.

Risultati

C. elegans embrioni esposti a grave carenza di ossigeno (anossia) sono in grado di sopravvivere con l'arresto di processi biologici tra cui lo sviluppo e la divisione cellulare ^7. L'anossia arresto indotto di divisione cellulare può essere monitorata, ad un livello sub-cellulare, utilizzando una camera microincubation in combinazione con flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotante per creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in ...

Discussione

Privazione di ossigeno e Suspended Animation

Sebbene l'esposizione alla carenza di ossigeno grave può essere fatale per alcuni organismi, alcuni organismi sono in grado di sopravvivere l'esposizione a anossia. Nel caso di C. elegans, la sopravvivenza di esposizione anossia dipende stadio di sviluppo e la risposta alla anossia è entrata in uno stato di animazione sospesa reversibile in cui sono stati arrestati una serie di processi biologici osservabili. Processi di divisione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti / Accessori			Composizione
Soluzione di ipoclorito di			0,7 g KOH, 12 ml NaOCl 5%, portare a 50 ml con DDH 2 0
M9 tampone			3 g KH 2 PO 4, 11 g di Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 per 1 L DDH 2 O
Vetro microscopio diapositive	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 millimetro
Turno micro coprioggetti	Scienze della microscopia elettronica	72223-01	25 mm Diametro
Halocarbon olio 700	Sigma	H8898-100ml
Anestetico			0,5% TricAine, 0,05% Tetramisole
Leiden chiuso perfusione Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP azoto	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Tubo in plastica	VWR	89068-468	0,062 "ID x 0.125" OD
Spinning microscopio confocale disco	McBain Sistemi		Zeiss microscopio ottico invertito, sistema di illuminazione epifluorescenza, CSU-10 Yokogawa scanner confocale, Hamamatsu moltiplicatore elettronico CCD.