Использование времени Lapse микроскопии для визуализации Anoxia вызванных Подвесные анимации в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Эмбрионы

Резюме

Описанные здесь В естественных условиях Техника для изображения субклеточных структур у животных, подвергшихся гипоксии помощью потока газа через microincubation камеры в сочетании с вращающимся диском конфокальной микроскопии. Этот метод прост и достаточно гибкой, чтобы удовлетворить различные параметры эксперимента и модельных системах.

Аннотация

Caenorhabdits Элеганс широко используется при исследовании устойчивости к стрессу, который способствует прозрачности взрослых и эмбрион стадии, а также наличие генетических мутантов и трансгенных линий выразить множество гибридных белков ^1-4. Кроме того, динамические процессы, такие как деление клетки может быть просмотрен с помощью флуоресцентно меченых белков репортер. Исследование митоза может быть облегчен за счет использования покадровой экспериментов в различных системах, включая нетронутыми организмов, поэтому рано C. Элеганс эмбрионов хорошо подходит для данного исследования. Представленный здесь метод, с помощью которого в естественных изображений субклеточных структур в ответ на бескислородных (99,999% N _2; <2 частей на миллион O ₂₎ напряжение можно с помощью простой поток газа через установку на мощный микроскоп. Microincubation камере используется в сочетании с азотом поток газа через и вращающийся диск конфокальной микроскопииДля создания контролируемой среды, в которой животные могут быть отображены в естественных условиях. Использование GFP с метками тубулина гамма-и гистонов, динамики и арест клеточного деления, можно контролировать до, во время и после воздействия лишенной кислорода среде. Результаты этой техникой высокого разрешения, подробные видео и изображения клеточных структур в бластомеров эмбриона подвергаются кислородное голодание.

протокол

1. Подготовка проб

1. Производить или получить соответствующие трансгенных C. Элеганс напрягать интереса с использованием трансгенных методологии или Caenorhabditis генетики фондовый центр (CGC) или коллеге. В этом случае мы используем штамм TH32 (пирог-1 :: ГТД-1 :: GFP, пирог-1 :: GFP :: H2B) ⁵ для визуализации хромосом и центросомы в качестве маркеров для деления клеток.
2. Создание синхронизированных населения с помощью одного из трех методов: 1) распадаются беременных взрослых в раствор гипохлорита и использовать оставшиеся эмбрионы ^6, 2) выбрать беременных взрослых на тарелку семенами, и пусть они лежали эмбрионов в течение 1-2 ч, или 3) выбрать L4 Личинки из смешанного населения и переход к новой пластинки семенами.
3. Расти нематод при 20 ° С до беременной молодой взрослой жизни, которая займет примерно 96 часов от вылупления, 72 часа от личинок L1 или 24 ч после L4 линьки. Эмбрионы (2-20 клеток) внутриутробно содержат большое бластомеров и ядер, которые являются оптимальными для IMAGING субклеточном и суб-ядерные изменения, соответственно. Эта методика обеспечивает средства для создания население молодых людей, которые содержат обильное количество ранних эмбрионов.

2. Подготовка слайдов и аноксии палаты Настройка

1. Сделать влажной камере провести подготовленные слайды, создав влажным бумажным полотенцем в большой чашке Петри или бен закрывают крышкой достаточного размера.
2. Подготовка расплавленный 2% агарозном в деионизованной H ₂ O при нагревании смесь в посуду с помощью микроволновой печи или ванну воды.
3. Поместите 1-3 капли теплого агарозы на чистое стекло микроскопа стекло. Немедленно поместите второй слайд инвертируется перпендикулярно сверху капли агарозы (ы), слегка прижмите так, чтобы в результате площадке будет тонким и без пузырьков воздуха.
4. Дайте время, чтобы охладить и медленно разбирать двух предметных стеклах оставляя нетронутыми площадку агарозы на одном из слайдов. Важно обеспечить площадку агарозы является достаточно тонким, чтобы не интерферометрыповторно с возможностью сфокусировать микроскоп позже. Возможность визуализировать образца также зависит от конкретной оптической расстояние объектива в использовании, которая может варьироваться от микроскопов.
5. Используйте чистые лезвия бритвы формировать агарозном площадку в небольшой площади. Хранить в подготовленную влажной камере до момента использования.
6. Осторожно, используя те же чистые лезвия бритвы, возьмите краю площадки агарозы и перевести его из слайдов на круглую 25 мм микро покровного стекла, что позволяет избежать накопления пузырьков воздуха под площадку. Круглый покровного стекла выбраны для использования подходит надлежащим образом в microincubator.
7. Добавить каплю анестетика (0,5% Tricaine, 0,05% tetramisole в M9 буфера) на площадке агарозы для использования в качестве анестетика. Возьмите 5-10 червей и место в каплю анестетика. Разрешить 1-3 мин для червей прекратить движение.
8. Основанием для наблюдения эмбрионов в матку взрослой, а не расчлененные эмбрионов, является сведение к минимуму потенциальных эмбрионов desiccaния и движения в связи с потоком газообразного азота через эмбриона.
9. Сразу добавить каплю масла галоидоуглеводородов на вершине черви, чтобы предотвратить червей от обезвоживания, как газ течет через камеру. С галоидоуглеводородов масло вязкое можно использовать кончик пипетки или кончик червя выбрать для сбора нефти и падение на червей.
10. После кругового покровного стекла содержащие червей готов, две половинки Leiden закрыты перфузии microincubator разделены, и покровного стекла затем осторожно помещают вертикально на дно кольцо. Две стороны камеры закрывается плотно вместе.
11. Затем камера подключена к танков азотом с помощью гибких пластиковых труб и помещен в соответствующее место на столике микроскопа (рис. 1С). На этот раз трубку и microincubator должны быть тщательно проверены на герметичность путем обеспечения надежного крепления труб и порта пробки вдоль стороны камеры. Можно Alтак легко распространиться небольшим количеством мыльной воды на трубы, чтобы искать пузырьков, из которых будет формироваться, если утечка присутствует.

3. Микроскопия в Anoxia

1. Найдите животных при меньшем увеличении, то перейдите к соответствующему большем увеличении (64x для этого приложения) тканей изображение или клетки интереса, таких как эмбриональные бластомеров или ооцитов у взрослых. Включите 488 нм лазер, чтобы просмотреть GFP сигнала и найти GFP гибридного белка в клетке (ы) интересов.
2. Для визуализации арест на определенном этапе клеточного цикла (например, поздней профазе) определить бластомеров на стадии предварительного деления клеток (например конце интерфазы или в начале профазы). Сотовый маркеров, таких как центриоли положение, начала конденсации хромосом, хромосомные расположение и наличие или отсутствие ядерной оболочки поможет определить стадии клеточного цикла (рис. 2A).
3. Затем камера перфузировались азотом (99,999%N _2; <2 частей на миллион O _2). В этом случае мы используем давление 6 бар, однако давление может нуждаться в корректировке и оптимизированы в зависимости от размера каждого microincubator и диаметр трубы в использовании. Продолжайте следить за бластомеров (ы) как азот заполняет камеру, настройка фокальной плоскости по мере необходимости.
4. На данный момент, покадровой визуализации начался. Изображениями ведется так долго, как необходимо захватить явление интерес, в этом случае ареста профазе и док-хромосом к внутренней ядерной мембраны. Изображения взяты каждые 10 секунд в течение не более 30 мин. Частоты захвата изображения и такие параметры, как коэффициент усиления и мощность лазера должна быть скорректирована по мере необходимости.
5. Время, в котором эмбрионы реагировать на бескислородной среде может меняться в зависимости от клеточной стадии цикла при воздействии гипоксии. Обычно гипоксия-индуцированный профазы ареста происходит в течение 20-30 мин начала потоке газообразного азота. Мы наблюдали гипоксия-индуцированного клеточного цикла заниrring в <20 мин. Изображения могут быть получены в течение этого времени, или конкретные образы могут быть выделены позднее с покадровой серии. Дополнительной опцией является использование видео микроскопии для визуализации субклеточных структур в эмбрионах.
6. Для восстановления документов от кислородного голодания вызванных арестован состоянии, газ выключен и камеры разрешили вернуться в нормоксии путем диффузии во время записи замедленной серии. Возобновление клеточного цикла и расстыковки хромосом обычно происходит в течение 5-20 мин превращения газообразного азота прочь.
7. Отметим, что в отдельных экспериментах показатель кислородное голодание, Resazurin, был помещен в проточную микрокамеры, было установлено, что камера становится бескислородных в среднем около 19 мин после потоком газообразного азота начался.
8. Изображения и видео обрабатываются с помощью Imaris, Image J или Photoshop и импортировать в QuickTime для отображения.

Результаты

C. Элеганс эмбрионы подвергаются сильным кислородное голодание (гипоксия) способны выжить, арестовав биологических процессов, включая развитие и деление клеток ^7. Гипоксия-индуцированный арест клеточного деления можно контролировать, на субклеточном уровне, используя microincu...

Обсуждение

Лишение кислорода и подвесные Анимация

Хотя воздействие тяжелых лишений кислорода может быть фатальным для некоторых организмов, некоторые организмы способны выживать воздействия кислородное голодание. В случае C. Элеганс, выживание воздействия гипоксии зависит о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагенты / Оборудование			Состав
Раствор гипохлорита			0,7 г KOH, 12 мл 5% NaOCl, довести до 50 мл DDH 2 0
M9 буфера			3 г KH 2 PO 4, 11 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl, 1 мл (1 M) MgSO 4 на 1 л DDH 2 O
Предметные стекла микроскопа	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 мм
Круглый микро покровного стекла	Электрон наук микроскопии	72223-01	25 мм Диаметр
Галокарбоновое масло 700	Сигма	H8898-100ml
Обезболивающий			0,5% электрическоеАйне, 0,05% tetramisole
Leiden Закрытая перфузии Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP азота	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 частей на миллион O 2
Пластиковые трубы	VWR	89068-468	0,062 "ID х 0,125" OD
Вращающийся диск конфокальной микроскопа	McBain системы		Zeiss инвертированного оптического микроскопа, эпифлуоресцентной системы освещения, CSU-10 Yokogawa конфокальный сканер, Hamamatsu электронный умножитель CCD камера.