El uso de microscopía lapso de tiempo para Visualizar anoxia inducida animación suspendida en<em&gt; C. elegans</em&gt; Los embriones

Resumen

Descrito aquí es un In vivo Técnica de imagen sub-estructuras celulares en animales expuestos a la anoxia usando un flujo de gas a través de la cámara de microincubation en conjunción con un microscopio confocal de disco giratorio. Este método es sencillo y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una variedad de parámetros experimentales y los sistemas del modelo.

Resumen

Caenorhabdits elegans se ha usado extensivamente en el estudio de la resistencia a la tensión, que se ve facilitado por la transparencia de las fases adultas y el embrión así como por la disponibilidad de mutantes genéticos y cepas transgénicas que expresan una miríada de ^1-4 proteínas de fusión. Además, los procesos dinámicos tales como la división celular se puede ver con la etiqueta fluorescente proteínas indicadoras. El estudio de la mitosis se puede facilitar mediante el uso de experimentos con lapso de tiempo en los diferentes sistemas, incluyendo organismos intactos, por lo que la temprana C. embrión elegans es muy adecuado para este estudio. Aquí se presenta una técnica mediante la cual la formación de imágenes in vivo de estructuras subcelulares en respuesta a anóxica (99,999% N _2; <2 ppm O ₂₎ el estrés es posible con un flujo de gas a través de la configuración sencilla en un microscopio de alta potencia. Una cámara de microincubation se utiliza en conjunción con el flujo de gas de nitrógeno a través de un microscopio y disco giratorio confocalpara crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obtener imágenes in vivo. Uso de GFP-etiquetados tubulina gamma y la histona, la dinámica y la detención de la división celular puede ser controlada antes, durante y después de la exposición a un ambiente privado de oxígeno. Los resultados de esta técnica son de alta resolución, videos detalladas y las imágenes de las estructuras celulares dentro de blastómeros de embriones expuestos a privación de oxígeno.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Producir u obtener apropiado C. transgénico elegans cepa de interés utilizando metodologías transgénicas o de Genética Caenorhabditis Stock Center (CGC) o colega. En este caso estamos usando la cepa TH32 (pastel-1 :: TBG-1 :: GFP; pastel-1 :: GFP :: H2B) ⁵ para visualizar los cromosomas y los centrosomas como marcadores para la división celular.
2. Generar una población sincronizado mediante uno de tres métodos: 1) se desintegran adultos grávidas en una solución de hipoclorito y el uso de embriones sobrantes ^6, 2) recoger los adultos grávidas en un plato sin semillas y dejar que ellos se extendía embriones durante 1-2 horas, o 3) recoger L4 larvas de una población mixta y pasar a una nueva placa sembrada.
3. Crecer nematodos a 20 ° C hasta la edad adulta joven embarazada, que durará aproximadamente 96 horas de incubación, 72 horas a partir de larvas L1 ó 24 horas después de la muda L4. Embriones (2-20 celular) en el útero contener blastómeras grandes y núcleos que son óptimas para imagción sub-celulares y sub nucleares cambios, respectivamente. Esta metodología proporciona un medio para generar una población de adultos jóvenes que contienen un número abundante de embriones tempranos.

2. Preparación de diapositivas y la Cámara Anoxia Configuración

1. Hacer una cámara húmeda para retener muestras preparadas mediante la colocación de una toalla de papel húmeda en el interior de una gran placa de Petri o compartimiento cubierto con una tapa de tamaño suficiente.
2. Preparar fundido agarosa al 2% en H2O _desionizada, calentando la mezcla en recipientes de vidrio a través de microondas o baño de agua.
3. Ponga 1-3 gotas de cálida agarosa sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio. Colocar inmediatamente una segunda corredera invertida perpendicularmente en la parte superior de la gota de agarosa (s), presiona ligeramente de modo que la almohadilla resultante será delgada y libre de burbujas de aire.
4. Dar tiempo a que se enfríe lentamente y desmontar los dos portaobjetos dejando intacta la almohadilla de agarosa en una de las diapositivas. Es importante asegurar la almohadilla de agarosa es lo suficientemente delgada como para no interfevolver con la capacidad de enfocar el microscopio después. Capacidad de visualizar la muestra es también depende de la distancia óptica específica del objetivo en uso, que puede variar entre los microscopios.
5. Use una hoja de afeitar limpia para dar forma almohadilla de agarosa en una pequeña plaza. Almacenar en la cámara húmeda preparada hasta que esté listo para usar.
6. Con cuidado, utilizando la hoja de afeitar limpia mismo, tomar el borde de la almohadilla de agarosa y transferirla desde el portaobjetos sobre un cubreobjetos redondo 25 mm micro, evitando la acumulación de burbujas de aire debajo de la almohadilla. El cubreobjetos redondo seleccionado para usar encaja adecuadamente en el microincubator.
7. Añadir una gota de anestésico (0,5% tricaína, 0,05% tetramisol en M9 buffer) en la almohadilla de agarosa para uso como anestésico. Elige gusanos 5-10 y colóquelos en la gota de anestésico. Permita 1-3 min para los gusanos de cesar el movimiento.
8. El fundamento para observar los embriones en el útero adulto, en vez de embriones disecados, es reducir al mínimo el potencial de embrión desecaciónción y el movimiento debido al flujo de gas nitrógeno a través del embrión.
9. Inmediatamente se añade una gota de aceite de halocarbono en la parte superior de los gusanos para evitar que los gusanos de la deshidratación de gas se hace fluir a través de la cámara. Dado que el aceite de halocarbono es viscoso se puede usar una punta de pipeta o punta de un gusano de selección para recoger el petróleo y caen sobre los gusanos.
10. Una vez que el cubreobjetos circular que contiene los gusanos está listo, las dos mitades de la Leiden cerrado perfusión microincubator se separan, y el cubreobjetos es entonces cuidadosamente colocados de pie sobre la parte inferior del anillo. Los dos lados de la cámara se cierran herméticamente juntos.
11. La cámara se conecta entonces al depósito de gas nitrógeno a través de tubo de plástico flexible y se coloca en el lugar apropiado en la platina del microscopio (Figura 1C). En este momento el tubo y microincubator deben verificarse cuidadosamente para detectar cualquier fuga, garantizando una fijación segura de la tubería y de las clavijas de puerto a lo largo del lado de la cámara. Uno puede altan ligeramente extendió una pequeña cantidad de agua de jabón sobre el tubo en busca de burbujas, los cuales formarán si existe una fuga.

3. Microscopía en Anoxia

1. Localice los animales a un menor aumento, entonces, pasar a la magnificación superior que les corresponda (64x para esta aplicación) para imágenes de tejido o células de interés, tales como blastómeros de embriones u ovocitos en los adultos. Encender el láser de 488 nm para ver la señal del GFP y GFP localizar proteína de fusión en la célula (s) de interés.
2. Para visualizar la detención en la fase específica de la detención del ciclo celular (por ejemplo profase tardía) identificar un blastómeros en una fase anterior de la división celular (por ejemplo, interfase profase temprana o tardía). Marcadores celulares tales como la posición de centríolos, la iniciación de la condensación de cromosomas, localización cromosómica y la presencia o ausencia de la envoltura nuclear ayudará a identificar la etapa del ciclo celular (Figura 2A).
3. Entonces la cámara se perfundió con gas nitrógeno (99,999%N _2; <2 ppm O _2). En este caso se utiliza una presión de 6 psi, sin embargo la presión puede necesitar ajustarse y optimizarse en función del tamaño de cada microincubator y el diámetro del tubo en uso. Continuar controlando el blastómero (s) como el nitrógeno llena la cámara, ajustar el plano focal cuando sea necesario.
4. En este punto, imagen de lapso de tiempo ha comenzado. Formación de imágenes se llevó a cabo durante tanto tiempo como sea necesario para capturar fenómeno de interés, en este caso detención profase y acoplamiento de cromosomas a la membrana nuclear interna. Las imágenes son tomadas una vez cada 10 seg durante no más de 30 min. Las frecuencias de captura de imagen y ajustes tales como la ganancia y la potencia de láser debe ser ajustado como sea necesario.
5. El tiempo en el que los embriones de responder al medio ambiente anóxico puede variar dependiendo de la fase del ciclo celular después de la exposición anoxia. Típicamente anoxia inducida detención profase se produce dentro de 20-30 min de flujo de nitrógeno a partir de gas. Hemos observado anoxia inducida ciclo celular ocupación detenciónrencia en <20 min. Las imágenes se pueden obtener durante este marco de tiempo, o imágenes específicas se pueden aislar después de una serie de lapso de tiempo. Una opción adicional es el uso de microscopía de vídeo para visualizar las estructuras subcelulares en los embriones.
6. Para documentar la recuperación del estado anoxia inducida por el detenido, el gas se apaga y la cámara se le permitió regresar a normoxia por difusión durante la grabación de una serie de lapso de tiempo. La reanudación de la progresión del ciclo celular y el desacoplamiento de los cromosomas se produce normalmente dentro de 5-20 minutos de convertir el gas nitrógeno apagado.
7. Tenga en cuenta que en experimentos separados un indicador anoxia, resazurina, se colocó en la micro-cámara de flujo a través, se determinó que la cámara se vuelve anóxico en promedio de aproximadamente 19 min después de flujo de gas nitrógeno se ha iniciado.
8. Las imágenes y los vídeos se procesan utilizando Imaris, J Imagen o Photoshop e importados en QuickTime para la visualización.

Resultados

C. elegans embriones expuestos a privación de oxígeno grave (anoxia) son capaces de sobrevivir al detener procesos biológicos, incluyendo el desarrollo y la división celular ^7. La detención inducida por anoxia de la división celular se puede monitorizar, en un nivel sub-celular, mediante el uso de una cámara de microincubation en conjunción con flujo de nitrógeno y gas a través de un microscopio confocal de disco giratorio para crear un ambiente controlado en el que los animales pueden obte...

Discusión

La privación de oxígeno y la animación suspendida

Aunque la exposición a la privación de oxígeno severa puede ser fatal para algunos organismos, algunos organismos son capaces de sobrevivir a la exposición a la anoxia. En el caso de C. elegans, la supervivencia de la exposición anoxia depende de la etapa de desarrollo y respuesta a la anoxia es la entrada en un estado de animación suspendida reversible en el que se detuvo a varios procesos biológicos observables. Los procesos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivos / Equipo			Composición
Solución de hipoclorito			0,7 g de KOH, 12 ml de NaOCl al 5%, llevar a 50 ml con ddH 2 0
M9 buffer de			3 g de KH 2 PO 4, 11 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 por 1 L ddH 2 O
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x1" x1.0 mm
Ronda micro cubreobjetos	Microscopía Electrónica de Ciencias	72223-01	Diámetro 25 mm
Halocarbono 700	Sigma	H8898-100ml
Anestésico			0,5% tricaine, 0,05% tetramisol
Leiden Cerrado perfusión Microincubator	Harvard Apparatus	650041
UHP Nitrógeno	Calgaz (Air Liquide)		> 99,9990% N 2 <2 ppm de O 2
Los tubos de plástico	VWR	89068-468	0,062 "ID x 0.125" OD
Microscopio Confocal Spinning disco	McBain Sistemas		Zeiss invertido microscopio óptico del sistema, iluminación epifluorescente, CSU-10 Yokogawa escáner confocal, Hamamatsu multiplicador de electrones CCD cámara.