L&#39;utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryons

Résumé

Décrit ici est un In vivo à l'image des structures sous-cellulaires chez les animaux exposés à une anoxie en utilisant un écoulement de gaz à travers la chambre microincubation en liaison avec un microscope confocal à disque rotatif. Cette méthode est simple et suffisamment souple pour s'adapter à une variété de paramètres expérimentaux et des systèmes modèles.

Résumé

Elegans Caenorhabdits a été largement utilisé dans l'étude de la résistance au stress, ce qui est facilité par la transparence des stades adultes et d'embryons ainsi que par la disponibilité de mutants génétiques et des souches transgéniques exprimant une myriade de ^1-4 des protéines de fusion. En outre, les processus dynamiques comme la division cellulaire peut être consulté en utilisant des protéines marquées par fluorescence reporter. L'étude de la mitose peut être facilitée par l'utilisation de time-lapse expériences dans divers systèmes, y compris les organismes intacts; ainsi le début C. embryon elegans est bien adapté pour cette étude. Présentée ici est une technique par laquelle l'imagerie in vivo de structures subcellulaires en réponse à anoxique (99,999% de N _2; <2 ppm ₂ O) le stress est possible en utilisant un flux de gaz simple grâce à l'installation sur un microscope très puissant. Une chambre microincubation est utilisé en conjonction avec un débit d'azote gazeux à travers et un microscope confocal à disque rotatifà créer un environnement contrôlé dans lequel les animaux peuvent être imagé in vivo. Utilisant la GFP-tubuline marqués gamma et des histones, la dynamique et arrêt de la division cellulaire peut être surveillé avant, pendant et après l'exposition à un environnement privé d'oxygène. Les résultats de cette technique sont en haute résolution, des vidéos et des images détaillées des structures cellulaires au sein de blastomères d'embryons exposés à la privation d'oxygène.

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Produire ou obtenir approprié transgénique C. elegans souche d'intérêt en utilisant des méthodes transgéniques ou de Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) ou d'un collègue. Dans ce cas, nous utilisons souche TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP, tarte-1 :: GFP :: H2B) ⁵ à visualiser les chromosomes et les centrosomes comme marqueurs de la division cellulaire.
2. Générer une population synchronisée en utilisant l'une des trois méthodes suivantes: 1) se désintègrent adultes gravides dans une solution d'hypochlorite et d'utiliser des embryons restants ^6, 2) choisir adultes gravides ensemencées sur une plaque et laissez-les poser embryons pendant 1-2 heures, ou 3) prendre L4 larves d'une population mixte et de passer à une nouvelle plaque ensemencée.
3. Cultivez les nématodes à 20 ° C à l'âge adulte gravide, ce qui prendra environ 96 heures à partir de l'éclosion, les larves de 72 heures à partir de L1 ou L4 24 h après la mue. Embryons (2-20 cellules) in utero contiennent de grandes blastomères et des noyaux qui sont optimales pour imagtion des changements sub-cellulaires et sub-nucléaire, respectivement. Cette méthodologie fournit un moyen pour générer une population de jeunes adultes qui contiennent un nombre abondant d'embryons précoces.

2. Préparation Faites glisser et anoxie Chambre Set Up

1. Faites une chambre humide à tenir lames préparées en plaçant une serviette en papier humide à l'intérieur d'un grand plat de Pétri ou dans le bac recouvert d'un couvercle de taille suffisante.
2. Préparer fondu 2% d'agarose dans désionisée H ₂ O par chauffage dans de la verrerie mélange par micro-ondes ou bain d'eau.
3. Placer 1-3 gouttes d'eau tiède agarose sur une lame de microscope en verre propre. Placer immédiatement une deuxième lame inversée verticalement au-dessus de la chute d'agarose (s), appuyez légèrement de sorte que le coussin résultant sera mince et sans bulles d'air.
4. Laisser le temps de refroidir lentement et démonter les deux lames de microscope en laissant intact le tampon d'agarose sur une des diapositives. Il est important d'assurer le pad agarose est assez mince pour ne pas perturre avec la capacité de se concentrer au microscope après. Possibilité de visualiser l'échantillon dépend aussi de la distance optique spécifique de l'objectif utilisé, qui peut varier entre microscopes.
5. Utilisez une lame de rasoir propre pour façonner tampon d'agarose dans un petit carré. Conserver dans la chambre humide préparée jusqu'au moment de servir.
6. Soigneusement, en utilisant la même lame de rasoir propre, prendre le bord du pad agarose et le transférer de la faire glisser sur un rond de 25 mm lamelle micro, en évitant l'accumulation de bulles d'air sous le clavier. La lamelle ronde choisi d'utiliser s'insère correctement dans le microincubator.
7. On ajoute une goutte d'anesthésique (0,5% tricaïne, tétramisole 0,05% en tampon M9) sur le bloc d'agarose destiné à être utilisé comme anesthésique. Choisissez les vers 5-10 et lieu dans la goutte d'anesthésique. Laisser 1-3 min pour les vers à cesser le mouvement.
8. La justification de l'observation des embryons dans l'utérus adulte, au lieu d'embryons disséqués, est de minimiser le potentiel de l'embryon desiccation et le mouvement dû à l'écoulement du gaz d'azote dans l'embryon.
9. Immédiatement ajouter une goutte d'huile halocarbone au-dessus des vers de terre pour empêcher les vers de déshydratation de gaz s'écoule à travers la chambre. Comme l'huile est visqueuse halocarbures, on peut utiliser un embout de pipette ou de la pointe d'un ver prendre pour recueillir l'huile et déposer sur les vers de terre.
10. Une fois la lamelle circulaire contenant les vers est prêt, les deux moitiés de la fermeture Leiden perfusion microincubator sont séparées, et la lamelle est ensuite soigneusement placé à la verticale sur l'anneau inférieur. Les deux côtés de la chambre sont ensuite fermées hermétiquement ensemble.
11. La chambre est ensuite reliée au réservoir d'azote gazeux par l'intermédiaire de tubes en matière plastique souple et placé à l'endroit approprié sur la platine du microscope (figure 1C). À ce moment le tube et microincubator doit être soigneusement contrôlée pour les fuites en assurant une fixation sûre de la tuyauterie et des bouchons d'orifice le long du côté de la chambre. On peut ALsi légèrement étaler une petite quantité d'eau savonneuse sur le tube de chercher des bulles, qui formeront si une fuite est présente.

3. Microscopie en anoxie

1. Localiser les animaux à faible grossissement, puis déplacez le grossissement supérieur approprié (64x pour cette application) pour les tissus d'image ou cellules d'intérêt tels que blastomères embryonnaires ou des ovocytes chez les adultes. Activer le laser 488 nm pour afficher signal de la GFP et de localiser la protéine de fusion GFP dans la cellule (s) d'intérêt.
2. Pour visualiser l'arrestation au stade précis de l'arrêt du cycle cellulaire (par exemple prophase tardive) d'identifier un blastomère à un stade antérieur de la division cellulaire (par exemple interphase prophase tardive ou précoce). Marqueurs cellulaires tels que la position centriole, l'initiation de la condensation des chromosomes, la localisation chromosomique et la présence ou l'absence de l'enveloppe nucléaire aidera à identifier les étapes du cycle cellulaire (figure 2A).
3. La chambre est ensuite perfusé avec de l'azote gazeux (99,999%N _2; <2 ppm O _2). Dans ce cas, nous utilisons une pression de 6 psi, mais la pression peut avoir besoin d'être ajustée et optimisée en fonction de la taille de chaque microincubator et le diamètre du tuyau en cours d'utilisation. Continuer à surveiller le blastomère (s) que l'azote remplit la chambre, le réglage du plan focal selon les besoins.
4. À ce stade, imagerie time-lapse a commencé. L'imagerie est réalisée aussi longtemps que nécessaire pour capturer phénomène d'intérêt, dans ce cas prophase arrestation et l'amarrage des chromosomes à la membrane nucléaire interne. Les images sont prises une fois toutes les 10 sec pour une durée de 30 min. Les fréquences de capture d'image et des paramètres tels que le gain et la puissance du laser doit être ajustée si nécessaire.
5. Le temps pendant lequel les embryons répondre à l'environnement anoxique peut varier selon le stade du cycle cellulaire lors de l'exposition anoxie. Typiquement arrestation prophase anoxie induite se produit dans les 20-30 min de commencer flux d'azote gazeux. Nous avons observé une anoxie induite occu arrêt du cycle cellulairerring à <20 min. Les images peuvent être obtenus au cours de cette période, ou des images spécifiques peuvent être isolés par la suite d'une série time-lapse. Une autre option est d'utiliser la vidéo-microscopie de visualiser des structures subcellulaires dans les embryons.
6. Pour documenter la récupération de l'état d'anoxie induite par arrêté, le gaz est éteint et que la chambre est autorisé à retourner à la normoxie par diffusion lors de l'enregistrement d'une série time-lapse. Reprise de la progression du cycle cellulaire et le désarrimage des chromosomes se produit généralement dans les 5-20 min de transformer l'azote gazeux hors tension.
7. Notez que dans des expériences séparées un indicateur anoxie, résazurine, a été placé dans la microchambre accréditives, il a été déterminé que la chambre devient anoxique, en moyenne, d'environ 19 minutes après l'écoulement du gaz d'azote a commencé.
8. Images et vidéos sont traitées à l'aide Imaris, Image J ou Photoshop et importés dans QuickTime pour l'affichage.

Résultats

C. elegans embryons exposés à la privation d'oxygène sévère (anoxie) sont capables de survivre en arrêtant les processus biologiques, y compris le développement et ⁷ de la division cellulaire. L'arrestation anoxie induite par la division cellulaire peut être contrôlé, à un niveau sub-cellulaire, en utilisant une chambre microincubation en conjonction avec flux d'azote gazeux à travers un microscope et confocale à disque rotatif pour créer un environnement contrôlé dans leq...

Discussion

La privation d'oxygène et de Suspended Animation

Bien que l'exposition à la privation d'oxygène graves peuvent être mortels pour certains organismes, certains organismes sont capables de survivre à l'exposition à l'anoxie. Dans le cas de C. elegans, la survie de l'exposition anoxie dépend du stade de développement et de réponse à l'anoxie est entrée dans un état ​​d'animation suspendue réversible dans lequel un certain nombre de processu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs / Équipement			Composition
Solution d'hypochlorite			0,7 g de KOH, 12 ml de NaOCl 5%, porter à 50 ml avec de ddH 2 0
M9 tampon			3 g de KH 2 PO 4, 11 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 pour 1 L ddH O 2
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-550-343	3 "x 1" x1.0 mm
Round micro lamelle	Sciences microscopie électronique	72223-01	25 mm Diamètre
Huile halocarbone 700	Sigma	H8898-100ml
Anesthésique			Trique de 0,5%aine, tétramisole 0,05%
Leiden perfusion fermé Microincubator	Harvard Apparatus	650041
L'azote UHP	CALGAZ (Air Liquide)		> 99,9990% de N 2 <2 ppm O 2
Tubes en plastique	VWR	89068-468	0.062 "ID x 0.125" OD
Microscope confocal Spinning Disk	Systèmes McBain		Zeiss inversé microscope optique, système d'éclairage à épifluorescence, CSU-10 Yokogawa confocale scanner, Hamamatsu multiplicateur d'électrons caméra CCD.