השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Summary

תאר כאן In vivo טכניקה למבני תמונת משנה הסלולר בבעלי חיים שנחשפו לחוסר חמצן באמצעות זרימת גז דרך חדר microincubation בשיתוף עם מיקרוסקופ confocal דיסקה מסתובב. שיטה זו היא פשוטה וגמישה מספיק כדי להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים ומערכות מודל.

Abstract

elegans Caenorhabdits כבר נעשה שימוש נרחב בחקר עמידות למצבי עקה, שהקלה על ידי השקיפות של השלבים הבוגרים ועובר, כמו גם על ידי הזמינות של מוטציות גנטיות וזנים מהונדסים המבטאים את מספר עצום של חלבוני היתוך ^1-4. בנוסף, תהליכים דינמיים כגון חלוקת תא ניתן לצפות באמצעות חלבונים שכותרתו fluorescently כתב. המחקר של מיטוזה ניתן מתאפשר באמצעות השימוש בניסויי זמן לשגות במערכות שונות, כוללים אורגניזמים שלמים, ולכן מוקדם ג עובר elegans גם מתאים למחקר זה. מוצג כאן היא טכניקה שבאמצעותה בתחום הדמית vivo של מבנים תת סלולריים בתגובה לanoxic (99.999% N _2; <2 עמודים לדקת פלט ₂₎ לחץ אפשרי באמצעות זרימת גז פשוט ועד התקנה במיקרוסקופ רב עצמה. קאמרי microincubation משמש יחד עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובבכדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית בעלי חיים בחי. שימוש GFP מתויג-טובולין גמא והיסטון, הדינמיקה ומעצרו של חלוקת תא ניתן לנטר לפני, במהלך ולאחר החשיפה לסביבת חמצן מקופח-. התוצאות של טכניקה זו הן ברזולוציה גבוה, קטעי וידאו ותמונות מפורטים של מבנים תאיים בתוך לסטומרים של עוברים שנחשפו למחסור בחמצן.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

1. לייצר או להשיג המהונדס ג המתאים elegans להתאמץ עניין שימוש במתודולוגיות מהונדסות או מCaenorhabditis גנטיקת מלאי מרכז (CGC) או קולגה. במקרה זה אנו משתמשים במתח TH32 (עוגה-1 :: TBG-1 :: GFP; עוגה-1 :: GFP :: H2B) ⁵ לדמיין הכרומוזומים וcentrosomes כסמנים לחלוקת תא.
2. צור אוכלוסייה מסונכרנת באמצעות אחת מהשלוש שיטות: 1) תתפורר מבוגרים הרה בתמיסת היפוכלוריט ולהשתמש עוברים שנותרו ^6, 2) לאסוף מבוגרים הרה לצלחת seeded ונותן שיגעו לעוברים 1-2 שעות, או 3) לאסוף L4 זחלים מאוכלוסייה ומהלך מעורב לצלחת seeded חדשה.
3. לגדול נמטודות ב 20 ° C לבגרות הרה צעירה, שתיקח כ 96 שעות מבקיעה, 72 שעות מזחלי L1 או נשירת 24 שעתי הודעת L4. עוברים (2-20 תא) ברחם מכילים לסטומרים וגרעינים גדולים שהם אופטימליים למתארים לעצמיing שינויים תת סלולריים ותת גרעיניים, בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של צעירים המכילים מספר שופע של עוברים מוקדמים.

2. הכנת מצגת וanoxia קאמרי הגדרה

1. הפוך תא לח להחזיק שקופיות שהוכנו על ידי הצבת מגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי גדולה או פח מכוסה במכסה בהיקף מספיק גדול.
2. הכן מותך 2% agarose בdeionized H ₂ O על ידי חימום תערובת זכוכית באמבטיה באמצעות מיקרוגל או מים.
3. הנח 1-3 טיפין של agarose החם בשקופית מיקרוסקופ זכוכית נקיה. מייד למקם את השקופית שנייה ההפוכה ניצב בראש טיפת agarose (הים), לחץ מעט כדי שהמשטח שיתקבל יהיה דק וללא בועות אוויר.
4. לאפשר זמן להתקרר ולפרק לאט את שתי שקופיות מיקרוסקופ עוזבים את כרית agarose שלם על אחת המגלשות. זה חשוב כדי להבטיח את כרית agarose הוא דק מספיק כדי לא interfeמחדש עם היכולת להתמקד מיקרוסקופ מאוחר יותר. יכולת לחזות מדגם תלוי גם במרחק המסוים האופטי של המטרה בשימוש, אשר יכול להשתנות בין מיקרוסקופים.
5. השתמש בסכין גילוח נקי לעצב כרית agarose בכיכר קטנה. אחסן בתא הלח המוכן עד מוכן לשימוש.
6. בזהירות, תוך שימוש באותה סכין הגילוח נקי, לקחת את קצה משטח agarose ולהעביר אותו מהשקופית על coverglass מ"מ מייקרו 25 עגול, הימנעות מההצטברות של בועות אוויר מתחת לכרית. Coverglass הסיבוב בחר להשתמש משתלב כראוי בmicroincubator.
7. הוסף טיפה של חומר ההרדמה (0.5% tricaine, tetramisole 0.05% בM9 חיץ) על כרית agarose לשימוש כחומר הרדמה. פיק תולעים ומקום 5-10 לירידה של חומר הרדמה. אפשר 1-3 דקות לתולעים להפסקות תנועה.
8. הרציונל להתבוננות עוברים בתוך הרחם הבוגר, במקום עוברים מכותרים, הוא למזער את הפוטנציאל של העובר desiccation ותנועה בגלל הזרימה של גז חנקן על פני העובר.
9. מייד להוסיף טיפת שמן halocarbon על גבי את התולעים כדי למנוע את התולעים מהתייבשות כזרם גז דרך החדר. מאז שמן halocarbon צמיג אחד יכול להשתמש בטיפ pipet או קצה תולעת לאסוף לאסוף נפט וירידה על התולעים.
10. ברגע coverglass המעגלי המכיל את התולעים מוכן, שני חצי ליידן נסגרו זלוף microincubator מופרדים, ואז coverglass הוא מונח בזהירות הזקופה לטבעת התחתונה. שני הצדדים של החדר לאחר מכן, סגורים היטב יחד.
11. לאחר מכן התא מחובר למכל גז החנקן באמצעות צינור פלסטי גמיש ולהציב לתוך המקום המתאים בשלב מיקרוסקופ (התרשים 1C). בשלב זה הצינור וmicroincubator צריכים להיבדק בזהירות לכל דליפות על ידי הבטחת התקשרות בטוחה של הצנרת ושל תקעי היציאה בצד של החדר. אפשר אלכך התפשט בקלילות כמות קטנה של מי סבון על הצינורות לחפש בועות, שתהווינה אם דליפה היא הווה.

3. מיקרוסקופי באנוקסיה

1. אתר חיות בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן, להעביר להגדלה המתאימה הגבוהה יותר (64x עבור יישום זה) לרקמת תאי תמונה או עניין כגון לסטומרים או ביציות עובריות במבוגרים. הפעל את ליזר ננומטר 488 כדי להציג אות ה-GFP ולאתר חלבון היתוך GFP בתא (הים) של עניין.
2. כדי להמחיש את המעצר בשלב מסוים של מחזור תא מעצר (prophase מאוחר למשל) לזהות blastomere בשלב מוקדם של חלוקת תא (לדוגמא interphase מאוחר או prophase מוקדם). סמנים סלולריים כמו עמדת centriole, ייזום של עיבוי כרומוזום, כרומוזום מיקום ונוכחות או עדר של מעטפת הגרעין יסייעו לזהות שלב מחזור תא (איור 2 א).
3. אז הקאמרי הוא perfused עם גז חנקן (99.999%N _2; <2 עמודים לדקת פלט _2). במקרה זה אנו משתמשים בלחץ של 6 אטמוספרות, אולם לחץ ייתכן שיצטרך להיות מותאם ומותאם בהתאם לגודלו של כל microincubator וקוטר של צינורות בשימוש. המשך לעקוב אחר blastomere (הים) כחנקן ממלא את החדר, התאמת מטוס המוקד בהתאם לצורך.
4. בנקודה זו, הדמית זמן לשגות החלה. הדמיה מבוצעת לכל זמן שיידרש כדי ללכוד תופעה של עניין, במקרה המעצר הזה prophase והעגינה של כרומוזומים לקרום הגרעין הפנימי. תמונות נלקחות פעם אחת בכל 10 שניות לא יותר מ 30 דקות. תדרים של לכידת תמונה והגדרות כגון רווח וכוח הליזר צריכים להיות מותאמים לפי צורך.
5. הזמן שבו העוברים מגיבים לסביבת anoxic יכול להשתנות בהתאם לשלב מחזור התא בתגובה לחשיפת חמצן בדם. בדרך כלל מעצר prophase אנוקסיה מושרה מתרחש בתוך 20-30 דקות מתחילת זרימת גז חנקן. אנו צפינו occu עצירת מחזור התא אנוקסיה המושריתrring ב< 20 דקים '. תמונות ניתן לקבל במסגרת זמן זו, או תמונות מסוימות יכולות להיות מבודדות מאוחר יותר מסדרת הזמן לשגות. אפשרות נוספת היא להשתמש במיקרוסקופ וידאו לדמיין מבני משנה הסלולר בעוברים.
6. כדי לתעד את ההתאוששות מהמדינה נעצרה אנוקסיה המושרית, מופעל הגז מול וקאמרי הוא יורשה לחזור לnormoxia ידי דיפוזיה עת הקלטת סדרת זמן לשגות. חידוש התקדמות מחזור התא וundocking של כרומוזומים מתרחש בדרך כלל בתוך 5-20 דקות של כיבוי גז החנקן.
7. יש לציין כי בניסויים נפרדים מחוון חוסר חמצן, resazurin, הוצב בזרימה דרך microchamber; נקבע כי התא הופך anoxic בממוצע של כ 19 דקות לאחר שזרימת גז החנקן החלה.
8. תמונות וקטעי וידאו מעובדים באמצעות Imaris, התמונה J או פוטושופ ויובאו לQuickTime לתצוגה.

תוצאות

עוברי ג elegans החשופים למחסור בחמצן קשה (אנוקסיה) מסוגלים לשרוד במעצר תהליכים ביולוגיים הכולל פיתוח וחלוקת תא ^7. מעצר אנוקסיה המושרית של חלוקת תא יכול להיות במעקב, ברמת משנה הסלולר, באמצעות תא microincubation בשיתוף עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתו?...

Discussion

מחסור בחמצן ואנימצית מושעה

למרות חשיפה למחסור בחמצן חמור יכולה להיות קטלנית לאורגניזמים מסוימים, כמה אורגניזמים מסוגלים לשרוד חשיפה לחמצן בדם. במקרה של ג elegans, הישרדות חשיפת אנוקסיה תלויה על במה ותגובה לאנוקסיה התפתחותית היא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ריאגנטים / ציוד			הרכב
פתרון hypochlorite			0.7 גרם KOH, המ"ל NaOCl 12 5%, מביא ל50 מ"ל עם DDH 2 0
M9 חיץ			3 גרם KH 2 PO 4, 11 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, 1 המ"ל (1 M) 4 MgSO לL DDH 2 O 1
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית	הפישר סיינטיפיק	12-550-343	3 מ"מ "x1" x1.0
סיבוב המייקר coverglass	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72223-01	קוטר 25 מ"מ
שמן Halocarbon 700	סיגמא	H8898-100 מ"ל
חומר מרדים			0.5% tricAine, tetramisole 0.05%
ליידן הסגורה זלוף Microincubator	הרווארד Apparatus	650041
חנקן UHP	Calgaz (Liquide אוויר)		> 99.9990% N 2 <2 O 2 עמודים לדקה
צינורות פלסטיק	VWR	89068-468	.062 "מזהה x 0.125" OD
ספינינג confocal מיקרוסקופ דיסק	מערכות McBain		Zeiss התהפך מיקרוסקופ מערכת אופטית, epifluorescence תאורה, סורק CSU-10 Yokogawa confocal, מצלמת CCD מכפיל אלקטרוני Hamamatsu.