Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا عزل الخلايا الأولية السريع للنوع الثاني الفئران السنخية الظهارية (وادي) عن طريق الانتقاء السلبي تدفق cytometric. هذه تظهر قابلية عالية وادي والنقاء ومناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية بشأن دورها في أمراض الجهاز التنفسي مثل أمراض المناعة الذاتية أو المعدية.

Abstract

على مر السنين الماضية، مساهمة الخلايا السنخية نوع II الظهارية (وادي) لمختلف جوانب تنظيم المناعة في الرئة باعتراف متزايد. وقد ثبت للمشاركة في وادي إنتاج السيتوكينات في القصبات الهوائية الملتهبة والعمل حتى مع مستضد تقديم الخلايا في كل من العدوى والمناعة الذاتية خلايا T بوساطة 1-8. ولذلك، فهي مثيرة للاهتمام لا سيما أيضا في سياقات السريرية مثل التفاعل المفرط لمجرى الهواء والأجنبية المستضدات الذاتية وكذلك الإصابات التي تستهدف مباشرة أو غير مباشرة وادي. ومع ذلك، فإن فهمنا لوظائف المناعية مفصلة خدم وفقا لنوع الخلايا السنخية II الظهارية في رئة سليمة وكذلك في التهاب يبقى مجزأ. يتم تنفيذ العديد من الدراسات المتعلقة باستخدام الماوس وادي ظيفة أو السنخية الإنسان خطوط الخلايا الظهارية 9-12. العمل مع خطوط الخلايا يوفر بالتأكيد مجموعة من المزايا، مثل توافر أعداد كبيرة سو خلايا لتحاليل واسعة النطاق. ومع ذلك، فإننا نعتقد أن استخدام الفئران وادي الابتدائية يسمح فهم أفضل لدور هذه نوع من الخلايا في العمليات المعقدة مثل العدوى أو التهاب المناعة الذاتية. يمكن عزل وادي الفئران الأولية مباشرة من الحيوانات تعاني من أمراض الجهاز التنفسي مثل هذه، وهذا يعني أنها كانت تخضع لعوامل خارجي إضافية عن لعب دور في الإعداد تحليلها. وعلى سبيل المثال، يمكن عزل وادي قابلة للحياة من الفئران المصابة بفيروس A الأنف الأنفلونزا، الذي يستهدف في المقام الأول هذه الخلايا للنسخ المتماثل 13. الأهم من ذلك، من خلال عدوى فيفو السابقين من وادي معزولة عن الفئران السليمة، ويمكن للدراسات التي شنت على الاستجابات الخلوية العدوى مزيد الموسعة.

ويستند لدينا بروتوكول لعزل وادي الفئران في المقام الأول على الهضم الأنزيمي في الرئة الماوس تليها وصفها لتعليق الخلية الناتج مع الاجسام المضادة المحددة لCD11c، CD11b، F4/80،CD19، CD45 وCD16/CD32. ثم يتم تحديد وادي حبيبي ومبعثر وغير المسماة sideward عالية (SSC عالية) السكان الخلية والخلية تكون مفصولة المنشط مضان الفرز 3.

بالمقارنة مع طرق بديلة لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الرئتين الماوس، لدينا لعزل بروتوكول تدفق cytometric من وادي ينتج عن طريق الانتقاء السلبي لم يمسها، وادي قابلة للحياة عالية ونقية في وقت قصير نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من الاساليب التقليدية في العزلة من قبل بالغسل واستنزاف الخلايا الليمفاوية عن طريق ربط الأجسام المضادة من جانب الخرز المغناطيسي 14 و 15، وتدفق الخلايا cytometric الفرز يسمح التمييز عن طريق حجم الخلية ومستوى. بالنظر إلى أن الأجهزة للفرز تدفق خلية cytometric متاح، يمكن تطبيق الإجراءات الموصوفة بتكاليف منخفضة نسبيا. بجوار الأجسام المضادة والأنزيمات القياسية للتفكك الرئة، لا الكواشف إضافية مثل المغناطيسيةويلزم الخرز. الخلايا المعزولة هي مناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية، والتي تشمل المختبر في الثقافة والمقايسات تحفيز خلايا T وكذلك transcriptome، بروتيوم أو تحليلات secretome 3 و 4.

Protocol

وترد التفاصيل المتعلقة الكواشف والمواد المطلوبة في الجدول في نهاية البروتوكول أدناه. قبل البدء في العمل، وإعداد أنابيب مل 15 (واحد في الماوس) تحتوي على 4 مل من dispase وقبل الدافئ لهم إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. في كتلة التدفئة، تدفئة قريبا مأخوذة صغيرة من 1٪ منخفضة تذوب الاغاروز (في الماء) إلى 95 ° C حتى المسال وبارد في وقت لاحق إلى C ° 45 حتى الاستخدام.

1. إعداد الرئة ماوس

  1. التضحية الماوس خنقا 2 CO. ملاحظة: لا تنفيذ خلع عنق الرحم حيث سيؤدي ذلك إلى إصابة القصبة الهوائية بحيث بعد خطوات من البروتوكول، مثل تركيب الرئة مع السائل، لا يمكن أن يؤديها بنجاح. ضمان فقدان ردود الفعل nociceptive.
  2. رش الفأر مع الايثانول وجعل قطع طويلة على طول خط الوسط بطني من الجسم. سحب الفراء والجلد البطني وبالتالي أيضا خفض بعناية وإزالة الغشاء البريتوني.
  3. ويستنزفالماوس عن طريق قطع الوريد الوداجي الأيمن والأيسر (الوريد الوداجي) وكذلك الشريان الكلوي (الشريان الكلوي). إزالة الأنسجة مع تدفق الدم.
  4. ثقب بعناية ثم قم بإزالة الحجاب الحاجز لفضح القلب والرئة عن طريق خفض بعيدا الأضلاع. عناية خاصة حتى لا أصيب في الرئة.
  5. مع قنية 26G وحقنة 10 مل مليئة الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS)، ثقب البطين الأيمن من القلب والرئة يروي مع PBS حتى خالية من الدم.
  6. قص وإزالة الغدد اللعابية لفضح القصبة الهوائية. كما قطعت بعناية العضلات المحيطة القصبة الهوائية.
  7. إدراج قنية الساكن 22G إلى القصبة الهوائية، وإزالة الإبرة ودفع القسطرة البلاستيكية نحو الرئة. إصلاح القسطرة عن طريق ربط قطعة صغيرة من خيوط حول القصبة الهوائية والقسطرة.

2. الأنزيمية الهضم في أنسجة الرئة

إذا رغبت، يمكن لعينة السائل غسل القصبات تكونالتي أعدتها بيغ الرئتين عن طريق القسطرة إدراجها في القصبة الهوائية مع PBS أو المتوسطة قبل الخطوة التالية.

  1. باستخدام حقنة مل 2، وبلغ حجم التداول بعناية غرس القصوى من 2 مل من dispase (من قسامة مل 4) في الرئة عن طريق القسطرة بحيث يتم توسيع بالكامل جميع الفصوص. تبادل المحاقن مع حقنة 1 مل تحتوي على 0.5 مل من الاغاروز المسال وغرس أيضا في الرئة.
  2. ترك الحقنة على القسطرة لمنع عودة التدفق من الاغاروز وتغطية مباشرة في الرئة مع المناديل الورقية المختبر والجليد. السماح للهلام الاغاروز لبضع دقائق.
  3. إزالة الأنسجة الورق، والجليد، وحقنة القسطرة، وقطع القصبة الهوائية والرئة استئصال والقلب والغدة الصعترية من الصدر. ثم شطف الرئة في طبق مع PBS وإزالة القلب والغدة الصعترية والقصبة الهوائية المتبقية.
  4. وضع الرئة في 2 مل المتبقية من dispase واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

3. إعداد الرئةالخلية تعليق

  1. إزالة الرئة من dispase وتحويلها إلى الطبق يحتوي على 7 مل من anti-CD16/32 الأجسام المضادة (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) في DMEM المتوسطة و 100 ميكرولتر الدناز.
  2. باستخدام ملقط، تتفكك تماما أنسجة الرئة عن طريق سحب إربا واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين تعصف بلطف على تعيين الروك إلى 200 دورة في الدقيقة. إذا رغبت، يمكن عندئذ وقف الخلية يتم تخزينها في C ° 4 حتى الخطوة التالية.
  3. تصفية التعليق الخلية من خلال تنسجم النايلون الأول مع 100 ميكرون وميكرون مع في وقت لاحق 70، 48 و 30 ميكرومتر ميكرومتر المسام. الحرص على شطف كل شبكة، فضلا عن أنابيب وأطباق تماما مع DMEM لتقليل الخسائر في الخلايا وزيادة العائد. إذا كنت تجميع عينات، لا يمكن تحقيق هذا عن طريق تمرير هنا في وقت لاحق من الفئران خلايا تعليق من مجموعة واحدة من خلال تصفية نفسه. تجديد التصفية في حالة انسداد.
  4. اعتمادا على حجم، نقل الترشيح على واحد أو أكثر أنابيب مل 50 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 160 XG ° C. و 4 إزالة طاف.
  5. إعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل العازلة تحلل كرات الدم الحمراء (0.15 M NH 4 الكلورين، 0.01 M KHCO 3، 0.1 مم EDTA، ودرجة الحموضة 7.2) وإنهاء تحلل بسرعة بإضافة من 13 مل من DMEM المتوسطة. الحل لنقل أنبوب 15 مل والطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 160 XG ° C. و 4

4. تلوين الأجسام المضادة للCytometric تدفق سيل الفرز

  1. إعادة تعليق الخلايا في 3 مل كوكتيل الأجسام المضادة الأولية، أعدت في DMEM المتوسطة في التخفيفات مناسبة لقياس التدفق الخلوي. (ومعاير من قبل الأجسام المضادة لعمل التخفيفات الأمثل من تلطيخ 1 × 10 6 splenocytes في مجلد من 100 ميكرولتر. استخدام 3 مل من مزيج الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على تركيزات الأمثل لكل من الأجسام المضادة المستخدمة للخلايا المجمعة من ما يصل الى خمسة الفئران. إذا يتم تجميع أكثر الفئران لعينة واحدة، ضبط مستوى الصوت).
  2. لتلطيخ، احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في الظلامعند 4 ° C.
  3. غسل الخلايا عن طريق ملء أنبوب 15 مل مع DMEM المتوسطة والطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 160 XG و 4 ° C.
  4. في حال كانت تستخدم الأجسام المضادة فكت أو المعقدة البيروكسيديز في 4.1: إزالة طاف و resuspend الخلايا في 2 - 3 مل كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية. وصمة عار لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
  5. غسل الخلايا من خلال ملء الأنبوب مع DMEM والطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 160 XG ° C. و 4
  6. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM وقبل فلتر من خلال تصفية 50 ميكرومتر في أنبوب للفرز الخلايا. اختياري: عد الخلايا للحصول على عدد الخلايا الكلي في الرئة تعليق الخلية.

5. الخلية الفرز

  1. خلط الخلايا عن طريق vortexing قبل الفرز. استخدام فوهة ميكرومتر 100 لفرز الخلايا من وادي. غمد ضغط السائل وكذلك الليزر وموجات الانبعاثات الاكتشاف تعتمد على الأداة المستخدمة لcytometric تدفق الفرز الخلية وكذلك fluorochromes المستخدمة في antibody تلطيخ الداخلي.
  2. بوابة على الخلايا التي هي عالية SSC سلبية على fluorochromes تستخدم لتلوين ونوع في أنبوب يحتوي على DMEM. استخدام قدما ارتفاع مبعثر (FSC-H) مقابل منطقة (FSC-A) وارتفاع sideward مبعثر (SSC-H) مقابل منطقة (SSC-A) ويندوز لاستبعاد أي الحلل أو المجاميع الخلية (انظر تفاصيل الاستراتيجية النابضة في الشكل 1 أ).
  3. من أجل جمع أجهزة الطرد المركزي الخلايا مصنفة لمدة 20 دقيقة في 280 XG و 4 ° C.
  4. إعادة تعليق الخلايا في الثقافة المتوسطة أو المخزن المؤقت على النحو المطلوب للتحليل لاحقة.

النتائج

عندما يكون الترتيب تعليق خلية الرئة معزولة عن الفئران السليمة، وبوابة وادي تمثل عادة لحوالي 42 ± 10٪ من كافة الأحداث. وهذا يمكن أن يكون أقل بشكل ملحوظ نسبة عند استخدام الفئران مع أمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب فيروسي، ووقف الخلية الأولي سوف تحتوي على نسبة أعلى بكثير م...

Discussion

بروتوكول لدينا لعزل وادي الفئران بواسطة التدفق الخلوي يوفر وسيلة سريعة للوصول الخلايا الأولية من الرئة الماوس لمجموعة كاملة من الدراسات الفنية والجزيئية. وصف الإجراء ينتج السكان للغاية وقابلة للحياة نقية من وادي التي هي كافية في عدد لاحق لتحاليل مباشرة، مثل العزلة...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر M. Höxter للمساعدة التقنية في وادي الفرز الأولية من عينات الفئران السلامة الأحيائية المستوى 2.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) لDB (SFB587، B12 TP وBR2221/1-1) وراتبا من البحوث الطبية الحيوية هانوفر مدرسة (DFG GSC 108) إلى AA. ويدعم DB من مبادرة الرئيس الخاصة وصندوق شبكة من مؤسسة هيلمهولتس لمراكز الأبحاث الألمانية (HGF) تحت W2/W3-029 عدد العقد.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
قنية الساكن Introcan 22G براون REF 4252098B
Dispase، 100 مل (5000 caseinolytic وحدات) BD العلوم البيولوجية 354235 قسامة إلى 4 مل في أنابيب مل 15، مخزن في -20 ° C
Biozym البلاك الاغاروز Biozym 840101 1 واط٪ / V 2 O H في
I ديوكسي ريبونيوكلياز من البنكرياس البقري، 2000 وحدة Kunitz / فيال سيغما الدريخ D4263 حل طازجة المحتوى من 1 فيال في 300 ميكرولتر DMEM
DMEM Gibco 22320-022 تستخدم على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة (G منخفضةlucose، بيروفات، HEPES)
مصافى الخلية (100 ميكرومتر و 75 ميكرومتر) BD الصقر 352360، 352350
شبكة النايلون (48 ميكرون، 30 ميكرون) Bückmann شركة محدودة 03-48/26-1020، 03-30/18-108
CellTrics مرشح ميكرون 50 بارتك Partec 04-0042-2317
مكافحة الماوس CD16/CD32 BioLegend 101302 استنساخ 93؛ المطهرون
مكافحة الماوس F4/80 BioLegend 123116 استنساخ BM8؛ APC يقترن
مكافحة الماوس CD11b BioLegend 101208 استنساخ M1/70؛ PE يقترن
مكافحة الماوس CD11c BioLegend 117310 استنساخ N418؛ APC يقترن
مكافحة الماوسCD45 BioLegend 103102 استنساخ 30-F11؛ المطهرون
مكافحة CD19 الماوس eBioscience 12-0193-83 eBio 1D3؛ PE يقترن
بولكلونل الماعز المضادة للمفتش الفئران BD Pharmingen 550767 بولكلونل، PE يقترن

ويمكن استخدام الأجسام المضادة بالإضافة إلى fluorochromes بديلة، اعتمادا على قياس التدفق الخلوي والليزر المتاحة.

References

  1. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
  2. Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
  3. Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
  4. Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
  5. Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
  6. Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
  7. Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
  8. Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
  9. Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
  10. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
  11. Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
  12. Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
  13. Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
  14. Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
  15. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
  16. Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
  17. Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
  18. Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
  19. Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

70

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved