기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

요약

우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.

초록

지난 수년 동안 폐의 면역 규제의 다양한 측면에 대한 폐포 타입 II 상피 세포 (AECII)의 후원금이 점차 인정 받고 있습니다. AECII는 염증 항공의 시토 킨 생산에 참여하고 감염 및 T-세포 매개 autoimmunity ^1-8 모두에서 세포를 항원 제시로도 역할을 표시하고 있습니다. 따라서, 그들은 그러한에게기도 하이퍼 반응 등 임상 상황에서도 특별히 흥미있는 외국인뿐만 아니라 자기 항원 직접 또는 간접적 AECII을 타겟팅 감염. 그러나, 건강한 폐뿐만 아니라 염증의 폐포 타입 II 상피 세포에 의해 제공 자세한 immunologic 기능에 대한 우리의 이해는 단편 남아 있습니다. AECII 기능에 관한 많은 연구가 ^9-12 마우스 또는 인간의 폐포 상피 세포 라인을 사용하여 수행됩니다. 세포 라인과 함께 일하는 것은 확실히 같은 많은 수의 가용성 O와 같은 혜택을 제공합니다광범위한 분석을위한 F 세포. 그러나, 우리는 기본 손쥐 AECII의 사용이 감염이나 면역 염증과 같은 복잡한 과정이 세포 유형의 역할에 대한 이해를 갖게 될 것입니다. 기본 손쥐 AECII들은 분석 설정에서 역할을 모두 추가 외부 요인에 따라되었습니다 즉, 같은 호흡기 질환을 앓고있는 동물에서 직접 분리 할 수​​ 있습니다. 예를 들어, 가능한 AECII은 intranasally 주로 복제 ^13이 세포를 대상으로 인플루엔자 바이러스에 감염된 생쥐에서 분리 할 수 있습니다. 중요한 것은, 건강한 쥐에서 분리 AECII의 전 생체 감염을 통해 감염에 장착 된 세포 반응의 연구는 더욱 확장 할 수 있습니다.

주요 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은, CD11c, CD11b, F4/80에 대한 특정 항체로 인한 세포 현탁액의 라벨 다음에 마우스 폐의 효소 소화에 기초CD19, CD45 및 CD16/CD32. 세분화 된 AECII 그 다음 높은 라벨과 측면의 분산 (SSC ^높은) 세포 인구로 식별되며 ³ 분류 형광 활성 세포로 구분됩니다.

마우스 폐에서 기본 상피 세포를 분리하는 다른 방법에 비해, 부정적인 선택에 의해 AECII의 흐름 cytometric 절연을위한 프로토콜은 비교적 짧은 시간에 손길이 닿지 않은, 매우 실용적 순수 AECII를 얻을. 또한, 및 패닝과 림프구의 고갈에 의한 절연이 기존의 방법과는 달리 항체 - 커플 링 자석 구슬 ^{14, 15의} 바인딩을 통해, 흐름 cytometric 셀 정렬은 셀 크기와 세분화에 의해 차별을 할 수 있습니다. 흐름 cytometric 셀 정렬을위한 장비를 사용할 수 있는지 감안할 때, 설명 절차는 상대적으로 낮은 비용으로 적용 할 수 있습니다. 표준 항체 및 폐 붕괴에 대한 효소 등 자기와 같은 별도의 시약 옆에구슬이 필요합니다. 절연 세포가 체외 문화와 T-세포 자극의 assays에서뿐만 아니라 transcriptome, 프로테옴 또는 secretome 분석 ^{3, 4} 등이 포함 기능 및 분자 연구, 다양한 적합합니다.

프로토콜

필요한 시약 및 재료에 관한 자세한 내용은 아래의 프로토콜의 끝 부분에 다음 표에 나열되어 있습니다. 작업을 시작하기 전에, 4 dispase의 ML과 ° C 물 목욕에 37 미리 따뜻하게을 포함하는 15 ML 튜브를 (마우스 하나씩)을 준비합니다. 가열 블록에서 곧 95-1% 낮은 용해 아가로 오스 (물)의 작은 aliquots를 가열 ° C 액화 때까지 사용 할 때까지 45 ° C에이어서 좋아.

1. 마우스 폐의 작성

1. CO ₂ 질식하여 마우스를 희생. 참고 : 성공적으로 수행 될 수 없습니다와 같은 액체와 폐의 설치로, 프로토콜의 단계를 수행하므로이 기관을 손상하므로 자궁 경부 전위를 수행하지 마십시오. nociceptive 반사 손실을 보장합니다.
2. 에탄올로 마우스를 뿌려서 몸의 복부 중간 선을 따라 긴 몫을합니다. 복부 털과 피부를 당겨하고 이후도 조심스럽게 잘라 복막을 제거합니다.
3. 을 ...에게서 피를 뽑다왼쪽과 오른쪽 경정맥 정맥 (베나 jugularis)뿐만 아니라 신장 동맥 (Arteria renalis)를 절단하여 마우스. 조직과 흐르는 혈액을 제거합니다.
4. 조심스럽게 다음 찔린하고 늑골을 멀리 절단하여 마음과 폐를 노출 할 수있는 피임기구를 제거합니다. 폐를 손상하지 특별히 조심하고.
5. 추위 인산로 가득 26G 캐뉼라와 10 ML의 주사기로 생리 (PBS), 찔린 심장의 우심실은 버퍼와 혈액의 무료까지 PBS로 폐를 perfuse.
6. 기관을 폭로 할 수있는 침샘을 잘라 제거합니다. 또한주의 깊게 호흡 관을 둘러싼 근육을 잘라.
7. 기관에 22G 내주하시는의 캐뉼라를 삽입하고, 바늘을 제거하고 폐에 대한 플라스틱 카테터를 밀어. 기관 및 카테터 주변 원사의 작은 조각을 매는하여 카테터를 해결했습니다.

2. 폐 조직의 효소 소화

원하는 경우, bronchoalveolar 세척 유체 샘플 수다음 단계 전에 PBS 또는 매체 기관에 삽입 된 카테터를 통해 폐를 플러싱으로 준비했습니다.

1. 2 ML의 주사기를 사용하여주의 깊게 모든 엽이 완전히 확장되도록 카테터를 통해 폐에 dispase 2 ML (4 ML의 나누어지는에서)의 최대 볼륨을 심어. 액화 아가로 오스의 0.5 ML를 포함하는 1 ML의 주사기와 주사기를 교환하고 또한 폐에 심어.
2. 아가로 오스의 다시 흐름을 방지하고 즉시 실험실 티슈과 얼음으로 폐를 커버 할 수있는 카테 테르에 주사기를 둡니다. 몇 분의 아가로 오스 젤을 보자.
3. , 휴지, 얼음, 주사기와 카테터를 제거 기관 및 소비세 폐, 심장과 가슴에서 thymus을 잘라. 그런 다음 PBS와 접시에 폐를 씻어 심장, thymus와 나머지 기관을 제거합니다.
4. dispase의 나머지 두 ML에 폐를 넣고 45 분 동안 실온에서 알을 품다.

3. 폐의 작성세포 현탁액

1. dispase에서 폐를 제거하고 DMEM 매체 100 μl DNase에 anti-CD16/32 항체의 7 ML (1 μg / ML 최종 농도)를 포함하는 요리로 전송.
2. 집게를 사용하여 완전히 떨어져 당겨 폐 조직을 분해하고 부드럽게 200 RPM으로 설정 로커에 흔들 동안 실온에서 10 분에 품다. 원하는 경우, 세포 현탁액은 다음 단계까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 100 μm와 이후 70 μm, 48 μm 및 30 μm 구멍이있는 첫번째 나일론 meshes를 통해 세포 현탁액을 필터링 할 수 있습니다. 세포의 손실을 최소화하고 수익을 극대화 할뿐만 아니라 DMEM으로 튜브 철저히 요리 각 메쉬를 씻어하는데주의를 기울여야. 당신이 샘플을 풀링하는 경우, 이것은 이후 같은 필터를 통해 한 그룹의 쥐에서 세포 현탁액을 통과하여 여기에 달성 될 수있다. 막힘의 경우 필터를 갱신.
4. 볼륨에 따라 하나 이상의 50 ML 튜브로 여과를 전송하고160 XG에서 15 분, 4 ° C.에 대해 원심 분리기 표면에 뜨는을 제거합니다.
5. 2 ML 적혈구 용해 완충액 (0.15 M NH ₄ 망할 CIA, 0.01 M KHCO _3, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.2)에 세포 펠렛을 Resuspend 빠르게 DMEM 매체 13 ML의 추가에 의해 용해을 해지 할 수 있습니다. 160 XG에서 12 분, 4 ° C.에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송

4. 흐름 Cytometric 셀 정렬에 대한 항체 염색법

1. 유동 세포 계측법에 적합한 dilutions에 DMEM 매체에 준비 3 ML 기본 항체 칵테일에 세포를 Resuspend. (항체는 이전에 100 μl의 볼륨에 1 개 10 ⁶ splenocytes 얼룩으로 최적의 작업 dilutions을 위해 titrated되었습니다. 사용 다섯 마우스까지에서 풀링 된 세포에 대한 사용 항체 각각에 대한 최적의 농도를 포함하는 차 항체 칵테일 3 ML. 더 많은 생쥐가 하나 샘플로 풀링하는 경우)의 볼륨을 조정합니다.
2. 착색를 들어, 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 배양4 번 ° C.
3. 12 160 XG에서 분, 4 DMEM 매체와 원심 분리와 함께 15 ML 튜브를 작성하여 세포를 씻으 ° C.
4. 경우 uncoupled 또는 biotinylated 항체는 4.1에 사용되었습니다 표면에 뜨는을 제거하고 2 세포를 resuspend - 3 ML 보조 항체 칵테일. 어둠 속에서 4에 10 분 ° C에 청바지.
5. 160 XG에서 12 분, 4 ° C.에 DMEM과 원심 분리로 관을 작성을 통해 세포를 씻으십시오
6. 셀 - 정렬의 튜브에 필터 50 μm을 통해 DMEM 및 사전 필터의 1 ML에있는 세포를 Resuspend. 선택 사항 : 폐 세포 현탁액의 전체 전화 번호를 얻기 위해 셀을 계산합니다.

5. 셀 - 정렬

1. 정렬하기 전에 vortexing하여 세포를 섞는다. AECII의 세포 분류에 100 μm의 노즐을 사용합니다. 칼집 유체 압력뿐만 아니라 레이저 방출 및 검출 파장은 흐름 cytometric 셀 정렬뿐만 아니라 antib에 사용 된 fluorochromes에 사용되는 악기에 따라 달라집니다ody 착색 절차.
2. DMEM을 포함하는 관으로 착색 및 정렬에 사용되는 fluorochromes에 대한 부정적인있는 SSC ^높은 세포에서 게이트. (SSC-A) 창 (에 게이팅 전략의 세부 정보를 확인하는 doublets 또는 셀을 합산에서 제외하는 분산 형 높이 (FSC-H) 대 면적 (FSC-A)와 옆으로의 분산 높이 (SSC-H) 대 면적 앞으로 사용 1)을 그림.
3. 20 280 XG에서 분, 4 정렬 셀 원심 분리기를 수집하기 위해 ° C.
4. 후속 분석을 위해 필요한 문화 중간이나 버퍼에있는 셀을 Resuspend.

결과

건강한 쥐에서 분리 폐 세포 현탁액을 정렬하면 AECII 게이트는 일반적으로 42 정도 차지합니다 ± 모든 이벤트의 10 %입니다. 이 비율은 초기 세포 현탁액은기도에 채용 림프구와 기타 면역 세포의 상당히 높은 비율을 포함하므로, 이러한 바이러스 감염과 같은 호흡기 조건에 마우스를 사용하는 경우 현저하게 낮을 수 있습니다. 3 일 다음과 같은 감염에 IAV 감염된 폐 격리 AECII 위해 우리는 약 50 % AEC...

토론

유동 세포 계측법에 의한 손쥐 AECII의 절연에 대한 프로토콜은 기능과 분자 연구의 모든 범위의 마우스 폐에서 기본 셀을 액세스의 급속한 방법을 제공합니다. 설명 절차는 RNA 분리 (그림 2B 참조) transcriptome 연구로 직접 후속 분석을위한 번호 충분 AECII의 높은 가능한 순수 인구를 산출. 기능 어플리케이션의 경우, AECII 에어컨, 중간 또는 공동 문화 실험의 생성 예 수 있도록, 문?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
내주하시는 캐뉼라 Introcan 22G	브라운	REF 4252098B
Dispase, 100 ML (5000 caseinolytic 단위)	BD Biosciences	354235	15 ML 튜브 4 ML에 나누어지는, -20 ° C에서 저장
Biozym 플라크 아가로 오스	Biozym	840101	H 2 O 1 % W / V
소 췌장, 2000 Kunitz 단위 / 유리 병에서 Deoxyribonuclease I	시그마 - 알드리치	D4263	갓 300 μl DMEM에 1 약병의 콘텐츠를 분해
DMEM	Gibco	22320-022	사용 등의 제조업체 (낮은 G에서 제공lucose, Pyruvate, HEPES)
셀 스트레이너 (100 μm, 75 μm)	BD 팔콘	352360, 352350
나일론 메쉬 (48 μm, 30 μm)	Bückmann GmbH의	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 μm 필터	PARTEC	04-0042-2317
안티 - 마우스 CD16/CD32	BioLegend	101302	클론 93, 정화
안티 - 마우스 F4/80	BioLegend	123116	클론 BM8, APC 결합
안티 - 마우스 CD11b	BioLegend	101208	클론 M1/70, PE 결합
안티 - 마우스 CD11c	BioLegend	117310	클론 N418, APC 결합
안티 - 마우스CD45	BioLegend	103102	클론 30 F11, 정화
안티 - 마우스 CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3, PE 결합
polyclonal 염소 안티 쥐 IgG	BD Pharmingen	550767	polyclonal, PE 결합
			대체 fluorochromes에 커플 링 된 항체가 사용할 수있는 흐름 cytometer와 레이저에 따라 사용할 수 있습니다.