Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований

Резюме

Мы описываем быстрого выделения первичных мышиных тип II альвеолярных эпителиальных клеток (AECII) методом проточной цитометрии отрицательного отбора. Эти AECII показывают высокую жизнеспособность и чистоты и подходят для широкого спектра функциональных и молекулярных исследований в отношении их роли в респираторных заболеваний, таких как аутоиммунные и инфекционные заболевания.

Аннотация

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity ^1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines ^9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication ¹³. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.

Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSC^high) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting ³.

In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads ^{14, 15}, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses ^{3, 4}.

протокол

Подробная информация о необходимых реактивов и материалов, перечисленных в таблице в конце протокола ниже. Перед началом работы, подготовить 15 мл трубки (по одному на мышь), содержащий 4 мл диспазы и предварительно нагреть их до 37 ° С на водяной бане. В нагревательный блок, вскоре нагревать небольшие аликвоты 1% легкоплавкой агарозы (в воде) до 95 ° C, пока сжиженный, а затем охлаждают до 45 ° C до использования.

1. Подготовка мышь легких

1. Жертва мыши, CO ₂ удушья. Примечание: Не выполняйте смещения шейных позвонков, так как это повредит трахеи, так что следующие шаги протоколов, таких как установка легких жидкость, не может быть выполнена успешно. Убедитесь, потеря ноцицептивных рефлексов.
2. Спрей мыши с этанолом и сделать длинный разрез вдоль вентральной срединной линии тела. Потяните брюшной меха и кожи, а затем и аккуратно вырезать и удалить брюшины.
3. Обескровитьмышь за счет сокращения левой и правой яремной вены (Vena jugularis), а также почечной артерии (Arteria renalis). Удалить течет кровь с ткани.
4. Осторожно прокола, а затем удалить диафрагму, чтобы открыть сердца и легких путем срезания ребер. Соблюдайте особую осторожность, чтобы не повредить легкие.
5. С 26G канюли и 10 мл шприц, заполненный холодным фосфатным буферным раствором (PBS), прокол правого желудочка сердца и заливать легких с PBS до бесплатного крови.
6. Вырезать и удалить слюнные железы, чтобы разоблачить трахеи. Также аккуратно вырезать мышцы окружающие трахею.
7. Вставьте канюлю 22G пребывающего в трахею, извлеките иглу и нажать на пластиковый катетер к легким. Закрепить катетер, связывая небольшой кусочек пряжи вокруг трахеи и катетер.

2. Ферментативного расщепления ткани легких

При желании, бронхоальвеолярного лаважа образцы жидкости может бытьподготовленный промывки легкие через катетер, введенный в трахею с PBS или среднего до следующего шага.

1. Использование 2 мл шприц, тщательно привить максимальный объем 2 мл диспазы (от 4 мл аликвоты) в легких через катетер, чтобы все лепестки раскрываются полностью. Заменить шприц с 1 мл шприц, содержащий 0,5 мл сжиженного агарозы, а также вселить в легких.
2. Оставьте шприц катетера для предотвращения обратного потока из агарозы и сразу покрытия легкого с лабораторией бумаги и льда. Пусть агарозном геле в течение нескольких минут.
3. Снимите салфетку, лед, шприцы и катетеры, сократить трахеи и акцизных легких, сердца и вилочковой железы из груди. Затем промыть легких в блюдо с PBS и удалить сердце, вилочковой железе и оставшиеся трахеи.
4. Положить легких в оставшиеся 2 мл диспазы и инкубировать при комнатной температуре в течение 45 мин.

3. Подготовка легкихСуспензии клеток

1. Удалить из легких диспазы и передать его в чашку, содержащую 7 мл anti-CD16/32 антитела (1 мкг / мл конечная концентрация) в среде DMEM и 100 мкл ДНКазы.
2. Используя щипцы, полностью разрушаются ткани легких, потянув ее на части и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре, мягко покачиваясь на рокера составляет 200 оборотов в минуту. При желании, суспензии клеток можно хранить при температуре 4 ° C до следующего шага.
3. Фильтр клеточной суспензии через нейлоновые сетки сначала с 100 мкм, а затем с 70 мкм, 48 мкм и 30 мкм поры. Позаботьтесь, чтобы промыть каждой сетки, а также труб и посуда тщательно DMEM, чтобы минимизировать потери клеток и увеличить доходность. Если вы объединения образцов, это может быть достигнуто здесь в дальнейшем прохождение клеток суспензии от мышей одной группы через тот же фильтр. Обновление фильтра в случае засорения.
4. В зависимости от объема, передает фильтрата с одним или более 50 мл пробирок ицентрифуге в течение 15 мин при 160 мкг и 4 ° C. Удалить супернатант.
5. Ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (0,15 М NH ₄ Cl, 0,01 М KHCO _3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2) и быстро прекратить лизис путем добавления 13 мл среды DMEM. Перенесите раствор в 15 мл трубки и центрифуги в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.

4. Окрашивание антител для проточной цитометрии Cell-сортировкой

1. Ресуспендируют клеток в 3 мл первичного коктейль антител, подготовленный в среде DMEM в разведении подходит для проточной цитометрии. (Антитела были ранее титровать для оптимальных рабочих разведений путем окрашивания 1 х 10 ⁶ спленоцитов в объеме 100 мкл. 3 мл использование первичных коктейль антител содержащих оптимальные концентрации для каждого из используемых антител к клеткам объединения с пяти мышей. Если больше мышей, объединяют в одном образце, регулировать громкость).
2. Для окрашивания, инкубировать клетки в течение 10 минут в темнотепри 4 ° C.
3. Вымойте клетки путем заполнения 15 мл трубки с DMEM среде и центрифугирования в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
4. В случае несвязанных или биотинилированные антитела были использованы в 4.1: Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 2 - 3 мл вторичном коктейль антител. Пятно в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
5. Вымойте клетки путем заполнения трубы с DMEM и центрифугирования в течение 12 мин при 160 мкг и 4 ° C.
6. Ресуспендируют клеток в 1 мл DMEM и фильтр предварительной очистки через 50 мкм фильтр в трубе для мобильных сортировки. Дополнительно: Считаем клетки, чтобы получить общее количество клеток в суспензии клеток легких.

5. Cell-сортировка

1. Смешать клеток путем перемешивания до сортировки. Используйте 100 мкм насадка для клеточной сортировки AECII. Оболочка давления жидкости, а также лазерного излучения и обнаружения длин волн зависят от инструментов, используемых для проточной цитометрии клеточного сортировки, а также флуорохромы используется в Антибоды окрашивания процедура.
2. Ворота на SSC ^{высококачественных элементов,} которые являются негативными для флуорохромы используется для окрашивания и сортировки в пробирке, содержащей DMEM. Используйте вперед разброс высоты (FSC-H) по сравнению области (FSC-A) и в сторону разброс высоты (SSC-H) по сравнению области (SSC-A) окна, чтобы исключить любые дублеты или клеточных агрегатов (подробнее см. строб-стратегии в Рисунок 1).
3. В целях сбора отсортированных клеток центрифуге в течение 20 мин при 280 мкг и 4 ° C.
4. Ресуспендируют клеток в культуре среднего или буфера, необходимого для последующего анализа.

Результаты

При сортировке клеток легких суспензий изолированы от здоровых мышей, ворота AECII, как правило, составляет около 42 ± 10% от всех событий. Этот процент может быть значительно ниже, если мышах с респираторными заболеваниями, такими как вирусные инфекции используются, в качестве начальной су...

Обсуждение

Наш протокол для выделения мышиных AECII с помощью проточной цитометрии предлагает быстрый способ доступа к первичной клетки из легких мышей целый ряд функциональных и молекулярных исследований. Описанная процедура дает весьма жизнеспособной и чистых популяций AECII, достаточные количе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
постоянная канюля 22G Introcan	Braun	REF 4252098B
Диспазы, 100 мл (5000 caseinolytic единиц)	BD Biosciences	354235	аликвоты по 4 мл на 15 мл пробирок, хранить при -20 ° C
Biozym налет Агароза	Biozym	840101	1% вес / объем в H 2 O
Дезоксирибонуклеазы я из бычьей поджелудочной железы, 2000 Куниц ЕД / флакон	Sigma-Aldrich	D4263	недавно растворить содержимое 1 флакона в 300 мкл DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	используется в качестве предоставляемых производителем (Low Glucose, пируват, HEPES)
ячейки сита (100 мкм, 75 мкм)	BD Falcon	352360, 352350
нейлоновая сетка (48 мкм, 30 мкм)	Buckmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 мкм фильтр	PARTEC	04-0042-2317
антимышиным CD16/CD32	BioLegend	101302	Клон 93; очищенный
антимышиным F4/80	BioLegend	123116	Клон BM8; APC связанная
антимышиным CD11b	BioLegend	101208	Клон M1/70, ЧП связанная
антимышиным CD11c	BioLegend	117310	Клон N418, связанных APC
антимышинымCD45	BioLegend	103102	Клон 30-F11; очищенный
анти-CD19 мыши	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3, связанных PE
поликлональные козьи анти-IgG крысы	BD Pharmingen	550767	поликлональных, PE связанных
			Антитела, связанные с альтернативными флуорохромы могут быть использованы, в зависимости от цитометра и лазеры доступны.