Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Resumo

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

Resumo

Ao longo dos últimos anos, a contribuição das células alveolares tipo II epiteliais (AECII) a vários aspectos da regulação imune no pulmão tem sido cada vez mais reconhecida. AECII têm sido mostrados para participar na produção de citoquina em inflamação das vias aéreas e ao mesmo actuar como células apresentadoras de antigénio, em ambos infecção e de células-T auto-imunidade mediada por ^1-8. Por isso, eles são particularmente interessantes também em contextos clínicos, tais como hiper-reactividade ao estrangeiro e auto-antigénios, bem como infecções que, directa ou indirectamente como alvo AECII. No entanto, a nossa compreensão das funções imunológicas detalhadas servidas por células de tipo II alveolares epiteliais no pulmão saudável, bem como na inflamação permanece fragmentária. Muitos estudos sobre a função AECII são realizadas usando o mouse ou humanos alveolares linhas de células epiteliais ^9-12. Trabalhando com linhas celulares certamente oferece uma série de vantagens, tais como a disponibilidade de grandes quantidades of células para análise extensiva. No entanto, nós acreditamos que a utilização de AECII murino primário permite um melhor entendimento sobre o papel deste tipo de células em processos complexos como infecção ou inflamação autoimune. AECII murino primário pode ser isolado directamente a partir de animais que sofrem de tais condições respiratórias, o que significa que foram sujeitos a todos os outros factores extrínsecos que desempenham um papel na definição analisados. Como um exemplo, AECII viável pode ser isolado a partir de murganhos intranasalmente infectados com o vírus influenza A, que tem como alvo as células principalmente para a replicação de ^13. É importante notar que com a infecção ex vivo de AECII isolado de ratos saudáveis, os estudos das respostas celulares montadas sobre a infecção pode ser ainda mais alargado.

O protocolo para o isolamento de AECII murino primário é baseada na digestão enzimática do pulmão de rato seguido de rotulagem da suspensão de células resultante com anticorpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 e CD16/CD32. AECII granulares são, em seguida, identificada como a dispersão não marcado e para o lado de alta (SSC ^alta) da população de células e são separados por classificação de células activadas por fluorescência ^3.

Em comparação com outros métodos de isolamento de células primárias epiteliais de pulmão de rato, o nosso protocolo para o isolamento de citometria de fluxo de AECII por selecção negativa produz intacta, AECII altamente viável e pura em tempo relativamente curto. Além disso, e em contraste com os métodos convencionais de isolamento por filtração e depleção de linfócitos através de ligação do anticorpo-esferas magnéticas acopladas ^{14, 15,} por citometria de fluxo de células para triagem de discriminação permite que, por meio de tamanho celular e granularidade. Dado que a instrumentação de separação de células por citometria de fluxo está disponível, o processo descrito pode ser aplicado a custos relativamente baixos. Ao lado de anticorpos normais e enzimas para a desintegração do pulmão, não reagentes adicionais, tais como magnéticoGrânulos são necessários. As células isoladas são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares, que incluem a cultura in vitro e ensaios de estimulação de células T, bem como transcriptoma, proteoma ou análises secretoma ^{3, 4.}

Protocolo

Os detalhes sobre os reagentes e materiais necessários estão listados na tabela, no final do protocolo abaixo. Antes de iniciar o trabalho, preparar tubos de 15 ml (um por rato) contendo 4 ml de dispase e pré-aquecê-los a 37 ° C num banho de água. Num bloco de aquecimento, logo aquecer pequenas alíquotas de 1% de agarose de baixa fusão (em água) a 95 ° C até liquefeito e, subsequentemente, arrefecer a 45 ° C até à sua utilização.

1. Preparação do pulmão do rato

1. Sacrificar o mouse por asfixia CO _2. Nota: Não realizar o deslocamento cervical como isso irá prejudicar a traqueia, de modo que na sequência de passos do protocolo, tal como a instalação do pulmão com um líquido, não pode ser realizada com sucesso. Assegurar a perda de reflexos nociceptivos.
2. Pulverizar o rato com etanol e fazer um corte de comprimento ao longo da linha média ventral do corpo. Puxe a pele ventral e pele e, posteriormente, também cuidadosamente cortar e remover o peritônio.
3. Desangrar orato, cortando a veia jugular esquerda e para a direita (Vena jugularis), bem como a artéria renal (renalis Arteria). Remover o sangue fluindo com tecido.
4. Punção cuidadosamente e retire o diafragma para expor o coração e pulmão cortando as costelas. Tome especial cuidado para não ferir o pulmão.
5. Com uma cânula 26G e uma seringa de 10 ml cheia com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS), a punção do ventrículo direito do coração e o pulmão perfundir com PBS até ficar livre de sangue.
6. Cortar e remover as glândulas salivares para expor a traquéia. Também corte cuidadosamente o músculo ao redor da traquéia.
7. Insira uma cânula 22G na traquéia, retire a agulha e empurrar o cateter plástico para o pulmão. Fixar o cateter, amarrando um pequeno pedaço de fio em torno traquéia e cateter.

2. A digestão enzimática do tecido pulmonar

Se desejado, uma amostra de fluido de lavagem broncoalveolar pode serpreparada por lavagem dos pulmões por meio do cateter inserido na traqueia com PBS ou meio antes do passo seguinte.

1. Utilizando uma seringa de 2 ml, cuidadosamente incutir um volume máximo de 2 ml de dispase (do alíquota de 4 ml) para o pulmão através do cateter de modo a que todos os lóbulos estão completamente expandida. Trocar a seringa com uma seringa de 1 ml contendo 0,5 ml de agarose a liquefeito e também instilar para o pulmão.
2. Deixar a seringa no cateter para evitar o refluxo da agarose e cobrir imediatamente o pulmão com papel de laboratório tecido e gelo. Deixe o gel de agarose para um par de minutos.
3. Remover o papel de tecido, o gelo, seringa e cateter, cortou a traqueia e excisão do coração, pulmão e timo do peito. Lavar o pulmão num prato com PBS e remover o coração timo e traqueia restante.
4. Coloque o pulmão para a 2 ml de dispase restante e incubar à temperatura ambiente durante 45 min.

3. Preparação do PulmãoSuspensão de células

1. Remover o pulmão do dispase e transferi-lo para um prato contendo 7 ml de anti-CD16/32 anticorpo (1 ug / ml de concentração final) em meio DMEM e 100 ul de DNase.
2. Usando fórceps, completamente desintegrar o tecido pulmonar, puxando-o à parte e incubar durante 10 min à temperatura ambiente enquanto agitando suavemente em um balancim fixado a 200 rpm. Se desejado, a suspensão de células podem então ser armazenadas a 4 ° C, até ao passo seguinte.
3. Filtra-se a suspensão de células através de malhas de nylon com 100 um primeiro e, subsequentemente, com 70 uM, 48 uM e 30 uM poros. Ter o cuidado de lavar cada malha, bem como os tubos e pratos cuidadosamente com DMEM para minimizar a perda de células e maximizar o rendimento. Se estiver a juntar amostras, isto pode ser conseguido por aqui posteriormente passando suspensões de células a partir de ratos de um grupo através do mesmo filtro. Substituir o filtro, em caso de entupimento.
4. Dependendo do volume e transferir o filtrado para um ou mais tubos de 50 ml ecentrifugar durante 15 min a 160 xg e 4 ° C. Remover o sobrenadante.
5. Ressuspender o sedimento de células em 2 ml de tampão de lise de eritrócitos (0,15 M NH ₄ Cl, 0,01 M _de KHCO3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,2) e rapidamente encerrar a lise por adição de 13 ml de meio DMEM. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 12 min a 160 xg e 4 ° C.

4. A coloração de anticorpo por separação celular por citometria de fluxo-

1. Ressuspender as células em 3 ml de cocktail de anticorpo primário, preparado em meio DMEM em diluições apropriadas para citometria de fluxo. (Os anticorpos foram previamente titulado para óptimos diluições de trabalho através da coloração de 1 x 10 ⁶ esplenócitos num volume de 100 ul. Uso de 3 ml do cocktail de anticorpo primário que contém as concentrações ideais para cada um dos anticorpos usados ​​para as células reunidas a partir de um máximo de cinco ratinhos. Se mais camundongos são reunidas para uma amostra, ajustar o volume).
2. Para a coloração, incubar as células durante 10 min no escuroa 4 ° C.
3. Lave as células através do enchimento do tubo de 15 ml com DMEM e centrifugação durante 12 min a 160 xg e 4 ° C.
4. No caso de anticorpos ou desacoplados biotinilados foram usados ​​em 4.1: Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 2-3 ml de cocktail de anticorpo secundário. Mancha durante 10 min a 4 ° C no escuro.
5. Lave as células através de enchimento do tubo com DMEM e centrifugação durante 12 min a 160 xg e 4 ° C.
6. Ressuspender as células em 1 ml de DMEM e pré-filtro através de um filtro de 50 um para um tubo de triagem de células. Opcional: Contar as células para se obter o número total de células na suspensão de células do pulmão.

5. De separação de células-

1. Misturar as células através de agitação em vórtice antes da triagem. Usar um bocal 100 para uM célula triagem de AECII. Pressão do invólucro de fluido, bem como de emissão laser e comprimentos de onda de detecção dependem do instrumento utilizado para a triagem de citometria de fluxo de células, bem como os fluorocromos utilizados na Antibody procedimento de coloração.
2. Portão sobre as células SSC ^elevados que são negativas para os fluorocromos utilizados para coloração e tipo para um tubo contendo DMEM. Use a frente altura de dispersão (FSC-H) versus área (FSC-A) e para o lado a altura de dispersão (SSC-H) versus área (SSC-A) janelas para excluir quaisquer doublets ou agregados celulares (veja detalhes da estratégia de propagação em Figura 1 a).
3. A fim de recolher a ordenada centrífuga células durante 20 min a 280 xg e 4 ° C.
4. Ressuspender as células em meio de cultura ou de tampão conforme necessário para a análise subsequente.

Resultados

Ao classificar suspensões de pulmão de células isoladas a partir de ratos saudáveis, o portão AECII normalmente responsáveis ​​por cerca de 42 ± 10% de todos os eventos. Esse percentual pode ser notavelmente menor quando os ratos com doenças respiratórias, como uma infecção viral são usadas, como a suspensão de células inicial vai conter uma proporção consideravelmente maior de linfócitos e outras células imunológicas recrutados para as vias aéreas. Para AECII isolada do pulmão IAV infectados no...

Discussão

O protocolo para o isolamento de AECII murina por citometria de fluxo proporciona uma forma rápida de aceder a partir de células primárias do pulmão do rato para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares. O procedimento descrito proporciona populações altamente viáveis ​​e puras dos AECII que são em número suficiente para directos análises subsequentes, tais como o isolamento de ARN (ver figura 2b) e os estudos de transcriptoma. Para aplicações funcionais, também é possível a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
habitação cânula Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml (5000 unidades caseinolítica)	BD Biosciences	354235	alíquota de 4 ml em tubos de 15 ml, armazenar a -20 ° C
Placa Biozym Agarose	Biozym	840101	1% w / v de H 2 O
Desoxirribonuclease I a partir de pâncreas bovino, 2000 unidades Kunitz / frasco	Sigma-Aldrich	D4263	recém dissolver o conteúdo de 1 frasco em 300 ul de DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	utilizado como fornecido pelo fabricante (G Lowlucose, piruvato, HEPES)
Os filtros celulares (100 um, 75 um)	BD Falcon	352360, 352350
malha de nylon (48 um, 30 um)	Buckmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 mM filtro	Partec	04-0042-2317
anti-rato CD16/CD32	BioLegend	101302	clone 93; purificada
anti-rato F4/80	BioLegend	123116	clone BM8; APC acoplado
anti-rato CD11b	BioLegend	101208	clone M1/70; PE acoplado
anti-rato CD11c	BioLegend	117310	clone N418; APC acoplado
anti-ratoCD45	BioLegend	103102	clone 30-F11; purificada
anti-mouse CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE acoplado
anticorpo policlonal de cabra anti-rato IgG	BD Pharmingen	550767	policlonal, PE acoplado
			Anticorpos acoplados a fluorocromos alternativos podem ser utilizados, dependendo do citómetro de fluxo e lasers disponível.