Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Résumé

Nous décrivons l'isolement rapide des primaires murins cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) par flux cytométrique sélection négative. Ceux-ci montrent AECII viabilité et à la pureté et conviennent à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires concernant leur rôle dans les affections respiratoires comme les maladies auto-immunes ou infectieuses.

Résumé

Au cours des dernières années, la contribution des cellules alvéolaires de type II épithéliales (AECII) à divers aspects de la régulation du système immunitaire dans le poumon a été de plus en plus reconnue. AECII Il a été démontré à participer à la production de cytokines dans les voies respiratoires enflammées et même agir comme cellules présentatrices d'antigène à la fois l'infection et des lymphocytes T auto-immunité médiée par ^1-8. Par conséquent, ils sont particulièrement intéressants dans les contextes cliniques tels que l'hyper-réactivité des voies aériennes à l'étranger et des auto-antigènes ainsi que les infections qui ciblent directement ou indirectement AECII. Cependant, notre compréhension des fonctions immunologiques détaillées desservis par les cellules alvéolaires de type II épithéliales des poumons en bonne santé ainsi que dans l'inflammation reste fragmentaire. De nombreuses études concernant la fonction AECII sont effectuées à l'aide de la souris ou l'homme lignées de cellules épithéliales alvéolaires ^9-12. Travailler avec des lignées de cellules offre certes de nombreux avantages, tels que la disponibilité d'un grand nombre of cellules pour des analyses approfondies. Cependant, nous croyons que l'utilisation de AECII murin primaire permet une meilleure compréhension du rôle de ce type de cellules dans des processus complexes comme l'infection ou une inflammation auto-immune. Primaire AECII murin peut être isolé directement à partir d'animaux qui souffrent de ces affections respiratoires, ce qui signifie qu'ils ont été soumis à tous les autres facteurs extrinsèques jouent un rôle dans la mise en analysés. A titre d'exemple, AECII viable peut être isolé à partir des souris infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe A, qui touche principalement les cellules à la réplication ^13. En outre, grâce infection ex vivo de AECII isolés de souris saines, l'étude des réponses cellulaires montés lors de l'infection peut être prolongée.

Notre protocole pour l'isolement de AECII murin primaire est basée sur la digestion enzymatique de la souris suivies par les poumons d'étiquetage de la suspension cellulaire obtenue avec des anticorps spécifiques de CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 et CD16/CD32. AECII granulaires sont ensuite identifiés comme non marqué et la dispersion latérale élevée (SSC ^haut) et population de cellules sont séparées par tri cellulaire activé par fluorescence ^3.

En comparaison à d'autres méthodes d'isolement de cellules primaires épithéliales de poumons de souris, notre protocole d'isolement par cytométrie de flux AECII par sélection négative donne intacte, très viable et pur AECII dans un temps relativement court. En outre, et contrairement aux méthodes conventionnelles d'isolement par le panoramique et l'épuisement des lymphocytes par l'intermédiaire de la liaison de l'anticorps couplés billes magnétiques ^{14, 15,} cytométrie en flux de tri cellulaire permet la discrimination par le biais de la taille des cellules et la granularité. Étant donné que l'instrumentation pour le tri cellulaire par cytométrie en flux est disponible, la procédure décrite peut être appliquée à des coûts relativement faibles. Suivant les anticorps et les enzymes standards pour la désintégration du poumon, pas de réactifs supplémentaires tels que magnétiqueperles sont nécessaires. Les cellules isolées sont adaptés à un large éventail d'études fonctionnelles et moléculaires, notamment la culture in vitro et des essais de stimulation des cellules T ainsi que transcriptome, du protéome ou des analyses sécrétome ^{3, 4.}

Protocole

Les détails concernant les réactifs et les matériaux requis sont répertoriés dans le tableau à la fin du protocole ci-dessous. Avant de commencer à travailler, préparer des tubes de 15 ml (un par souris) contenant 4 ml de dispase et préchauffer les à 37 ° C dans un bain-marie. Dans un bloc de chauffage, chauffer rapidement de petites aliquotes de 1% d'agarose bas point de fusion (dans l'eau) à 95 ° C jusqu'à ce que liquéfié et ensuite refroidir à 45 ° C jusqu'à utilisation.

1. Préparation du poumon de souris

1. Sacrifiez la souris par le CO ₂ asphyxie. Remarque: Ne pas effectuer dislocation cervicale car cela blesser la trachée afin que les étapes suivantes du protocole, tels que l'installation du poumon avec le liquide, ne peut pas être réalisée avec succès. Veiller à une perte des réflexes nociceptifs.
2. Pulvériser la souris avec de l'éthanol et de faire une longue incision le long de la ligne médiane ventrale du corps. Tirez le pelage ventral et la peau et par la suite aussi bien couper et enlever le péritoine.
3. Exsangue l'souris en coupant la veine jugulaire droite et gauche (veine jugulaire), ainsi que l'artère rénale (renalis Arteria). Retirez le sang qui coule avec le tissu.
4. Attentivement la perforation, puis retirer la membrane pour exposer le coeur et les poumons en coupant les côtes. Faites attention de ne pas blesser le poumon.
5. Avec une canule 26G et une seringue de 10 ml remplie de phosphate froid (PBS), la perforation du ventricule droit du cœur et le poumon perfuser avec du PBS jusqu'à disparition de sang.
6. Couper et enlever les glandes salivaires pour exposer la trachée. Aussi soigneusement coupé les muscles entourant la trachée.
7. Insérez une canule à demeure 22G dans la trachée, retirez l'aiguille et pousser le cathéter en plastique vers le poumon. Fixer le cathéter en attachant un petit morceau de fil autour de la trachée et du cathéter.

2. La digestion enzymatique du tissu pulmonaire

Si vous le souhaitez, un échantillon de fluide de lavage bronchoalvéolaire peut êtrepréparé par rinçage les poumons par l'intermédiaire du cathéter inséré dans la trachée ou avec du PBS support avant l'étape suivante.

1. En utilisant une seringue de 2 ml, soigneusement insuffler un volume maximal de 2 ml de dispase (à partir de l'aliquote de 4 ml) dans les poumons à travers le cathéter de sorte que tous les lobes sont pleinement développées. Échanger la seringue avec une seringue de 1 ml contenant 0,5 ml de la gélose liquéfiée et aussi instiller dans les poumons.
2. Laissez la seringue sur le cathéter pour empêcher le reflux de l'agarose et couvrir immédiatement les poumons avec du papier absorbant de laboratoire et de la glace. Laissez le gel d'agarose pour un couple de minutes.
3. Retirer le papier de soie, de la glace, la seringue et le cathéter, couper la trachée et de l'accise du poumon, le cœur et le thymus de la poitrine. Ensuite, rincez le poumon dans un plat avec du PBS et retirer le cœur, le thymus et la trachée reste.
4. Mettez le poumon dans le reste de 2 ml de dispase et incuber à température ambiante pendant 45 minutes.

3. Préparation du poumonSuspension cellulaire

1. Retirez le poumon de la dispase et le transférer dans un plat contenant 7 ml de anti-CD16/32 anticorps (1 pg / ml de concentration finale) dans du milieu DMEM et 100 ul de DNase.
2. En utilisant des pinces, complètement désintégrer le tissu pulmonaire en le tirant à l'écart et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante tout en secouant délicatement sur une bascule réglé à 200 tours par minute. Si vous le souhaitez, la suspension de cellules peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu'à l'étape suivante.
3. Filtrer la suspension de cellules à travers les mailles de nylon abord avec 100 um et par la suite avec 70 um, 48 um et 30 um pores. Prendre soin de laver chaque maille ainsi que les tubes plats et à fond avec du DMEM pour minimiser la perte de cellules et à maximiser le rendement. Si vous êtes mise en commun des échantillons, cela peut être réalisé ici par la suite, passant suspensions de cellules de souris d'un groupe à travers le même filtre. Remplacement du filtre en cas de colmatage.
4. En fonction du volume, de transférer le filtrat à un ou plusieurs tubes de 50 ml etcentrifuger pendant 15 min à 160 xg et 4 ° C. Enlever le surnageant.
5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de tampon de lyse des érythrocytes (0,15 M NH ₄ Cl, 0,01 M KHCO _3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) et mettre fin rapidement lyse par addition de 13 ml de milieu DMEM. Transférer la solution dans un tube de 15 ml et centrifuger pendant 12 min à 160 xg et 4 ° C.

4. La coloration d'anticorps de flux cellulaire par cytométrie de tri

1. Reprendre les cellules dans 3 ml de cocktail d'anticorps primaire, préparée dans du milieu DMEM à des dilutions appropriées pour la cytométrie en flux. (Anticorps ont été préalablement titrée pour les dilutions de travail optimales par coloration 1 x 10 ⁶ splénocytes dans un volume de 100 pl. Utiliser 3 ml de cocktail d'anticorps primaire contenant des concentrations optimales pour chacun des anticorps utilisés pour les cellules mises en commun d'un maximum de cinq souris. Si plus de souris sont mises en commun pour un échantillon, régler le volume).
2. Pour la coloration, incuber les cellules pendant 10 min dans l'obscuritéà 4 ° C.
3. Laver les cellules en remplissant le tube de 15 ml avec du milieu DMEM et centrifugation pendant 12 min à 160 xg et 4 ° C.
4. Dans le cas des anticorps biotinylé ou découplées ont été utilisés dans 4.1: Enlever le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 à 3 ml cocktail d'anticorps secondaire. Colorer pendant 10 min à 4 ° C dans l'obscurité.
5. Laver les cellules à travers le remplissage du tube avec du DMEM et centrifugation pendant 12 min à 160 xg et 4 ° C.
6. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de DMEM et de pré-filtre à travers un filtre 50 um dans un tube de tri cellulaire. En option: Compter les cellules pour obtenir le nombre total de cellules dans la suspension de cellules du poumon.

5. Tri cellulaire

1. Mélanger les cellules au vortex avant triage. Utiliser une buse de 100 um de tri cellulaire de AECII. Pression de fluide de gaine ainsi que des longueurs d'onde d'émission du laser et de détection dépend de l'instrument utilisé pour l'écoulement de tri cellulaire par cytométrie de même que les fluorochromes utilisés dans le ANTIBody procédure de coloration.
2. Porte sur les cellules CSE ^élevés qui sont négatifs pour les fluorochromes utilisés pour la coloration et le tri dans un tube contenant du DMEM. Utiliser avant la hauteur de dispersion (FSC-H) vs zone (FSC-A) et la hauteur de dispersion latérale (SSC-H) vs zone (SSC-A) fenêtres afin d'exclure tout doublets ou des agrégats de cellules (voir les détails de la stratégie de porte à Figure 1 a).
3. Afin de recueillir la centrifugeuse triés cellules pendant 20 min à 280 xg et 4 ° C.
4. Remettre en suspension les cellules dans la culture ou de support d'un tampon tel que requis pour une analyse ultérieure.

Résultats

Lors du tri des suspensions de cellules pulmonaires isolées à partir de souris saines, la porte sera AECII représentent généralement environ 42 ± 10% de tous les événements. Ce pourcentage peut être nettement plus faible lorsque les souris atteintes de maladies respiratoires telles que une infection virale sont utilisées, comme la suspension cellulaire initiale contient une proportion considérablement plus élevée de lymphocytes et d'autres cellules immunitaires recrutées pour les voies respiratoires. P...

Discussion

Notre protocole pour l'isolement des murin AECII par cytométrie en flux offre un moyen rapide d'accéder à des cellules primaires du poumon de souris pour toute une série d'études fonctionnelles et moléculaires. La procédure décrite donne populations très viables et pure de AECII qui sont en nombre suffisant pour les analyses ultérieures directes, telles que l'ARN isolés (voir figure 2b) et l'étude du transcriptome. Pour les applications fonctionnelles, il est également p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
demeure canule 22G Introcan	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml (5000 unités caséinolytiques)	BD Biosciences	354235	aliquote de 4 ml en tubes de 15 ml, à -20 ° C
Plaque Biozym Agarose	Biozym	840101	1% p / v dans H 2 O
Désoxyribonucléase I de pancréas bovin, 2000 unités Kunitz / flacon	Sigma-Aldrich	D4263	fraîchement dissoudre le contenu de 1 flacon dans 300 ul de DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	utilisé tel que prévu par le fabricant (Low Glucose, pyruvate, HEPES)
crépines cellulaires (100 um, 75 um)	BD Falcon	352360, 352350
filet de nylon (48 um, 30 um)	Buckmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics filtre 50 um	PARTEC	04-0042-2317
anti-souris CD16/CD32	BioLegend	101302	clone 93; purifié
anti-souris F4/80	BioLegend	123116	clone BM8; APC couplage
anti-souris CD11b	BioLegend	101208	clone M1/70; PE couplée
anti-souris CD11c	BioLegend	117310	clone N418, couplé APC
anti-sourisCD45	BioLegend	103102	clone 30-F11; purifié
anti-CD19 de souris	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE couplage
polyclonal de chèvre anti-IgG de rat	BD Pharmingen	550767	polyclonal, PE couplage
			Anticorps couplés à des fluorochromes alternatives peuvent être utilisées, selon le cytomètre de flux et de lasers disponibles.