主要鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能及分子生物学研究的流式细胞仪分离

摘要

我们描述了迅速隔离的主要鼠Ⅱ型肺泡上皮的细胞（AECII）流式细胞仪的负选择。这些AECII显示活力和纯度高，适用于范围广泛的功能和分子生物学研究，他们的作用，自身免疫性疾病或感染性疾病，如呼吸系统疾病。

摘要

纵观过去几年，各方面的免疫调节肺的肺泡Ⅱ型上皮的细胞（AECII）的贡献已被越来越多的认可。 AECII已显示出参与在发炎的气道的细胞因子的产生，甚至作为抗原呈递细胞在感染和T-细胞介导的自身免疫^1-8。因此，他们也特别有趣的气道高反应性的临床环境下，比如外资和自身抗原以及感染，直接或间接地针对AECII。然而，我们了解的详细服务的II型肺泡上皮细胞在肺的健康以及在炎症的免疫功能仍然是零碎的。许多的研究AECII功能是使用鼠标或^9-12人肺泡上皮细胞株。工作与细胞系确实提供了一系列好处，如提供大量ØF细胞广泛的分析。然而，我们相信使用的主要鼠AECII允许更好地了解复杂的过程，如感染或自身免疫性炎症的作用，这种细胞类型中。初级的的小鼠AECII可以直接从动物等呼吸系统疾病的痛苦，这意味着他们已经给所有其他的外在因素发挥作用的分析设置隔离。作为一个例子，可行的AECII可以分离出小鼠滴鼻感染A型流感病毒，主要目标，这些细胞的复制^13。更重要的是，通过从健康小鼠中分离的AECII 体外感染，安装在感染的细胞的反应的研究可以进一步延长。

是根据我们的协议进行的原发性小鼠AECII的隔离的小鼠肺然后通过标记所得到的细胞悬浮液与特异性抗体的CD11c，CD11b和F4/80，酶消化，CD19，CD45和CD16/CD32。颗粒AECII然后确定为未标记的和侧向散射（SSC ^高 ）细胞种群，并通过荧光激活细胞分选³被分离。

隔离小鼠肺上皮细胞的替代方法相比，我们的协议流式细胞仪分离的AECII负选择在比较短的时间内产生不动，高度可行的和纯AECII的。此外，和在常规的隔离方法，通过平移和淋巴细胞耗竭相反通过结合抗体耦合磁珠^14，15，流式细胞仪细胞分选允许通过细胞大小和粒度歧视。由于仪器流式细胞仪细胞分选是可用的，所描述的程序，可以应用于在相对低的成本。下一步标准的抗体和酶肺解体，不需要额外的试剂，如磁珠是必需的。分离的细胞是适用于范围广泛的功能和分子生物学研究，其中包括在体外培养细胞和T细胞刺激实验，以及转录组，蛋白质组或分泌的分析^3，4。

研究方案

关于所需的试剂和材料的细节在表中列出的，在端部的下面的协议。在开始工作之前，准备15毫升管（每一个鼠标），其中包含4毫升分离酶和预暖至37℃的水浴中。不久，在一个加热块1％低熔点琼脂糖（在水中）的小等分试样加热至95℃，直至液化并随后冷却至45℃，直至使用。

1。制备小鼠肺

1. 牺牲鼠标的CO ₂窒息。注意:不要进行颈椎错位，因为这将损害气管，使协议的步骤，如，如安装的液体肺，不能成功进行。确保伤害反射的损失。
2. 喷用乙醇和鼠标，使一个长期的切割，沿腹正中线的身体。拉腹部的皮毛和皮肤，随后还精心削减和删除腹膜的。
3. 抽血的切割的左和右颈静脉（ 腔jugularis）以及肾动脉（ 动脉renalis）的小鼠。拆下流动的血液与组织。
4. 小心穿刺，然后取出膜片，暴露心脏和肺切掉肋骨。要特别小心，不要伤到肺。
5. 有了一个26G插管和10毫升注射器充满冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS），穿刺的心脏的右心室，直到无血用PBS灌注肺。
6. 剪切和删除的唾液腺暴露气管。此外，小心切气管周围的肌肉。
7. 将一个22G留置气管插管插入，拔出针头，并推动对肺部的塑料导管。修复的导管，通过把一小块纱线围绕气管和导管。

2。肺组织的酶消化

如果需要的话，支气管肺泡灌洗液样品可以是制备通过在气管导管插入下一步骤之前，用PBS或培养基冲洗肺。

1. 使用一个2毫升的注射器，小心地注入2毫升分散酶（从4毫升）的最大体积的通过导管进入肺，使得所有裂片完全展开。交换含有0.5毫升液化琼脂糖用1ml注射器和注射器也进入肺灌输。
2. 将注射器留在导管上，以防止倒流琼脂糖并立即与实验室薄纸和冰覆盖肺。让琼脂糖凝胶一两分钟。
3. 取出纸巾，冰，注射器，导管，切断气管和消费的肺，心脏和胸部的胸腺。然后在培养皿中，用PBS冲洗肺，取出心脏，胸腺，其余气管。
4. 将肺成剩余的2毫升分散酶，并在室温下孵育45分钟。

3。制备的龙细胞悬浮

1. 取出肺从分散酶，并将其转移到一碟含7毫升的anti-CD16/32抗体的（1μg/ ml的最终浓度）在DMEM培养基和100μlDNA酶。
2. 使用镊子，完全瓦解拉它除了肺组织，并在室温下孵育10分钟，同时轻轻摇晃摇杆设置为200转。如果需要的话，然后可以被存储在细胞悬浮液在4℃下，直到下一个步骤。
3. 先用100微米，随后用70微米，48微米和30微米孔隙通过尼龙网过滤细胞悬浮液。照顾以及管和菜肴用DMEM彻底冲洗的各网格的单元格，以减少损失，并最大限度地提高产量。如果你正在汇集样品，这可以在这里实现，随后通过细胞悬浮液通过一组小鼠相同的过滤器。续约在堵塞的情况下的过滤器。
4. 根据卷上，将滤液转移到一个或多个50 ml离心管，并在160×g离心15分钟，4℃，离心除去上清液。
5. 在2ml红细胞裂解缓冲液（0.15 M NH _{4 Cl的} ，0.01M KHCO _3，0.1mM的EDTA，pH值7.2）中重悬细胞沉淀，并迅速终止通过加入13毫升的DMEM培养基中的溶解。在160×g离心12分钟，4℃，将该溶液转移到一个15毫升的试管和离心

4。抗体染色流式细胞仪检测细胞分选

1. 3毫升的主要抗体鸡尾酒，准备在DMEM培养基稀释适合流式细胞仪分析，重悬细胞。 （抗体先前为最佳工作稀释滴定进行染色1×10 ^6个脾细胞中的体积为100μl。使用为每个所用的抗体对细胞的最佳浓度的的初级抗体混合物含有的3毫升汇集来自五个小鼠的。如果有更多的老鼠被汇集到一个样本，调整音量）。
2. 染色，室温孵育10分钟，在黑暗中在4℃下
3. 洗涤细胞填充15毫升DMEM培养基并离心管，在160×g离心12分钟，和4℃。
4. 如果耦合或生物素标记的抗体用于4.1:去上清，悬浮细胞在2 - 3毫升二次抗体鸡尾酒。在黑暗中染色10分钟，在4°C。
5. 通过填充管在160×g离心12分钟，4℃，用DMEM和离心来洗涤细胞
6. 细胞重悬于1毫升DMEM和预过滤器中通过一个50微米的过滤器用于细胞分拣成管。可选:细胞计数，以获得总的在肺细胞悬浮液中的细胞数。

5。细胞分选

1. 振荡排序前的细胞混合。使用100μm的喷嘴用于细胞分拣AECII。护套的流体压力，以及激光发射和检测波长依赖于所用的仪器为流式细胞仪细胞分选的荧光染料，以及用于在antib全球最著名的染色过程。
2. 门上的SSC的^高细胞中，所使用的荧光染料染色和排序管DMEM是否定的。使用前向散射的高度（FSC-H） - 区域（FSC-A）和侧向散射的高度（SSC-H）与面积（SSC-A）窗口，以排除任何双峰或细胞聚集体（详见门控策略图1）。
3. 为了收集细胞，离心20分钟，在280 XG和4°C。
4. 重悬细胞培养介质或缓冲所需的后续分析。

结果

排序时从健康小鼠肺细胞悬浮液的分离，AECII门通常会占到约42±10％的所有事件。这个百分比可以是明显降低用于呼吸系统疾病，如病毒感染的小鼠时，作为初始的细胞悬浮液，将含有相当高的比例，淋巴细胞和其他免疫细胞的招募呼吸道。有关AECII分离从在第3天以下感染IAV感染肺部中，我们已经观察到细胞在AECII门的频率减少了大约50％。

一个典型的排序和重新排序的细胞?...

讨论

用流式细胞术隔离的小鼠AECII我们的协议提供了一个快速的方式访问主要的小鼠肺细胞的功能和分子生物学研究的整个范围。所描述的程序产生非常可行的，纯粹的人口AECII足够的数量，为的直接后续分析，如RNA分离（ 见图2b）和转录组的研究。对于功能性的应用程序，它也可以培养分离的细胞，允许， 例如生成AECII条件培养基或共培养实验。作为一个好处，尤其是对这些功能?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
留置套管Introcan 22G	布劳恩	REF 4252098B
中性蛋白酶，100毫升（5000酪蛋白单位）	BD Biosciences公司	354235	〜4毫升15毫升管分装，储存在-20°C
Biozym斑块琼脂糖	Biozym	840101	1％w / v在H 2 O
从牛胰腺，2000年Kunitz型单位/瓶的脱氧核糖核酸酶Ⅰ	Sigma-Aldrich公司	D4263	内容1瓶新鲜溶解在300μLDMEM
DMEM	Gibco公司	22320-022	作为制造商（低Glucose，丙酮酸，HEPES）
细胞粗滤器（100微米，75微米）	BD猎鹰	352360，352350
尼龙筛（48微米，30微米）	Bückmann有限公司	03-48/26-1020，03-30/18-108
CellTrics 50微米的过滤器	PARTEC	04-0042-2317
抗小鼠CD16/CD32	BioLegend	101302	克隆93;纯化
的抗小鼠F4/80	BioLegend	123116	克隆的BM8; APC耦合
抗小鼠CD11b的	BioLegend	101208	克隆M1/70，PE耦合
抗鼠的CD11c	BioLegend	117310	克隆N418，APC耦合
抗小鼠CD45	BioLegend	103102	克隆30-F11;纯化
抗鼠CD19	eBioscience公司	12-0193-83	生物质1D3，PE耦合
的多克隆山羊抗大鼠IgG	BD Pharmingen公司	550767	多克隆抗体，PE耦合
			耦合的替代荧光染料的抗体可用于，根据流式细胞仪和激光提供。