مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Summary

نحن هنا وصف طريقة لتفعيل وتوسيع خلايا NKT من معظم السكان الخلية باستخدام خلايا T مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC). استخدام CD1d القائم على AAPC يوفر طريقة موحدة لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا NKT الوظيفية.

Abstract

الطبيعية القاتلة T (NKT) الخلايا هي مجموعة فرعية من الخلايا T فريدة من نوعها التي تعرض علامات مميزة لكلا القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا وخلايا T ^1. على عكس الخلايا T الكلاسيكية، وخلايا الدهون NKT الاعتراف مستضد في سياق CD1 جزيئات ^2. الخلايا NKT إبداء ثابتة إعادة ترتيب سلسلة TCRα: Vα14Jα18 في الفئران والبشر في Vα24Jα18، الذي يرتبط مع سلاسل Vβ التنوع محدودة ^{3-6 و} ويشار إليه على أنه الكنسي أو ثابتة خلايا (ط NKT) NKT. مماثلة لخلايا T التقليدية، وخلايا CD4 NKT تطوير من CD8-T-التوتة خلايا السلائف بعد إشارات مناسبة من CD1d ^7. وزادت القدرة على الاستفادة من الخلايا لأغراض علاجية NKT بشكل كبير مع القدرة على تحفيز وتوسيع خلايا NKT مع Galactosylceramide-α (α-GalCer) ومجموعة متنوعة من السيتوكينات ^8. الأهم من ذلك، احتفظت هذه الخلايا الأصلية phenotypه، السيتوكينات يفرز، وظيفة السامة للخلايا ضد عرض خطوط الخلايا السرطانية. وهكذا، الخلايا خارج الجسم الموسعة NKT تبقى وظيفية، ويمكن استخدامها لعلاج مناعي بالتبني. ومع ذلك، فقد اقتصرت القائمة على الخلية NKT العلاج المناعي عن طريق استخدام خلايا مستضد ذاتي تقديم وكمية ونوعية هذه الخلايا يمكن أن تختلف إلى حد كبير مشجعا. تم الإبلاغ عن الوحيدات المستمدة من DC مرضى السرطان للتعبير عن انخفاض مستويات جزيئات costimulatory وإنتاج السيتوكينات الالتهابية أقل ^9،10. في الواقع، وقد استخدمت DC الفئران بدلا من APC ذاتي لاختبار وظيفة الخلايا من المرضى NKT CML ^11. ومع ذلك، لا يمكن إلا أن هذا النظام يستخدم لاختبار في المختبر حيث لا يتم توسيع الخلايا NKT بواسطة DC الفئران وتستخدم بعد ذلك لعلاج مناعي بالتبني. وهكذا، يمكن لنظام موحد يعتمد على خلايا مستضد تقديم الاصطناعي (AAPC) تنتج على المؤثرات المحفزة للDC بدون مطبات أو ألو م أعضاء غير بشريةLLS ^{12 و 13.} هنا، نحن تصف طريقة لتوليد CD1d القائم على AAPC. منذ إشراك مستقبلات الخلايا T (TCR) من CD1d مستضد المجمعات شرط أساسي لتنشيط الخلايا NKT، مستضد: مجمعات CD1d-IG توفر طريقة موثوق بها لعزل وتنشيطها وتوسيع المستجيب السكان الخلية NKT.

Protocol

1. جيل من AAPC

1. قبل إضافة إلى البروتينات والخرز، وإعداد جميع الكواشف ومخازن: 0.1M البورات العازلة؛ 1X PBS-D (لا كا ^{2 +} والمغنيسيوم ^{2 +)؛} حبة العازلة غسل (1X PBS +5٪ AB الإنسان المصل + أزيد الصوديوم 0.02٪) ؛ متكامل المتوسطة (RPMI متوسطة الصوديوم ملي +100 البيروفات، 10 ملي حل فيتامين غير الضرورية، 100 مم الحل فيتامين MEM، 1٪ 2-المركابتويثانول، 10 ميكرومتر سيبروفلوكساسين، 5٪ AB مصل الإنسان)؛ MACS العازلة (1 L PBS مجانا من الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2 + 2 +،} 5 ز BSA، و 2 EDTA ملمول).
2. شطف 1 مل الخرز الايبوكسي Dynabeads M-450 مع 3 مل العقيمة 0،1 العازلة البورات M (حمض البوريك والمياه، ودرجة الحموضة 7،0-7،4) في 5 مل قارورة زجاجية واضحة البورسليكات مترابطة.
3. في منفصلة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، إضافة 100 ميكروغرام hCD1d-IG ديمر و 20 ميكروغرام costimulatory جزيئات (على سبيل المثال: مكافحة CD28mAb) إلى 1 مل كا ث / س ^{2 +} PBS أو Mg ^{2 +.}
<لى> وضع حبة تحتوي على قارورة زجاجية على المغناطيس والرشفة العازلة بورات من الخرز. إضافة خليط من البروتين من الخطوة 1.2 إلى قارورة زجاجية واستبدال الغطاء. مزيج فورا فيال في قلب تغطي سقف مع parafilm، ووضعت على محور دوار واحتضان بين عشية وضحاها في C. ° 4
4. في اليوم التالي، ومكان قنينة زجاجية على جذب وإزالة خليط من البروتين، مع تجنب بعناية الخرز. غسل الخرز بإضافة 3 مل العازلة غسل حبة (PBS مع 5٪ AB أزيد الصوديوم في الدم +0.02٪)، واحتضان عند 4 ° C على محور دوار لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
5. ويمكن تخزين حبات في هذا الخليط غسل حبة. لجعل AAPC وظيفية، إزالة قسامة الصغيرة وعد الخرز باستخدام عدادة الكريات. تأكد من أن يتم تحميل ثابت البروتينات على حبات من تلطيخ مع الأجسام المضادة (مثلا: PE-مترافق المضادة للماوس IgG1) وإجراء تحاليل تدفق cytometric.
6. لتحميل الخرز مع مستضد، وإزالة 5 × 10 ⁷ حبات، وإضافة إلى قارورة صغيرة 1.5 مل الزجاج، الخرز شطف مع 1 مل العقيمة PBS. Rتغسل حبات esuspend مع 1 مل العقيمة PBS وإضافة مستضد؛ سبيل المثال: تحميل مع α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * ملاحظة: على الرغم من أننا لم الكشف عن أية مشاكل مع ذوبان الدهون أو تشكيل المذيلات، يجب التعامل مع الدهون وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. على وجه التحديد، أعيد تشكيل KRN7000 في DMSO (1mg/ml) لهذه الدراسات. ويمكن أيضا KRN7000 ومستضدات أخرى شحمي سكري يتم حلها في 0.2 ملغ / مل PBS تحتوي على 0.5٪ توين-20 (يصوتن 2 ساعة. في C ° 37). IMPORTANT-AAPC وتحتاج إلى أن يتم تحميل ما لا يقل عن 48-72 ساعة قبل استخدامها.

2. CD161 ⁺ عزل خلايا ⁺ CD3

1. جمع الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC). لكثافة الفصل Ficoll التدرج الطرد المركزي من الخلايا الليمفاوية من معطف الشهباء أو حزمة leukopheresis، تمييع الدم 1 heparinized مع حجم مساو من 1X PBS في درجة حرارة الغرفة.
2. إضافة 15 مل من Ficoll (تحسنت إلى درجة حرارة الغرفة) لأنابيب مخروطية 50 مل. تراكب ببطء25 مل من الدم المخفف الخليط على رأس Ficoll. أجهزة الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل قبالة.
3. إزالة بعناية واجهة اللمفاويات (الحلقة البيضاء بين وسائل الإعلام وFicoll) مع ماصة باستور ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل المخروطية.
4. غسل الخلايا عن طريق ملء الأنبوب إلى 50 مل مع PBS الطرد المركزي في و1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف والجمع الأنابيب من شخص واحد إلى واحد وأنبوب غسل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) مرة أخرى مع PBS مل 20. ثم عد PBMC و resuspend بتركيز من 5 ⁷ 10 X الخلايا / مل العازلة في MACS (1 L PBS خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2 + 2 +،} 5 ز BSA، و 2 ملمول EDTA).
5. من أجل عزل جزء الخلية T، وتبدأ مع 2 مل من PBMC (10 ⁸ خلايا) وإضافة 100 ميكرولتر من خلية T عموم الحل تخصيب من أدوات EasySep T الإنسان تخصيب الخلية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
6. إضافة 100 ميكرولتر من الجزيئات المغناطيسية في حل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. جلب الحجم النهائي من المذيبات إلى 2.5 مل ووضع أنبوب في المغناطيس الأرجواني لمدة 5 دقائق. صب بسرعة قبالة CD3 ⁺ جزء في أنبوب مخروطي 15 مل.
7. غسل الخلايا عن طريق إضافة 5 مل العازلة MACS الباردة، حساب عدد خلايا قابلة للحياة، وإزالة قسامة لتلطيخ FACS.
8. لتحديد الخلايا CD161 ^+، أولا إعادة تعليق التخصيب خلايا T في 980 ميكرولتر العازلة الجليد الباردة MACS، إضافة 10 ميكروغرام مكافحة CD161 ماب، واحتضان في الثلاجة لمدة 10 دقيقة.
9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة في C ° 4 لمدة 5 دقائق. ثم إعادة الخلية بيليه في 800 ميكرولتر من العازلة MACS. أضف 200 ميكرولتر من microbeads IgG1 المضادة للماوس واحتضان الحل لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
10. خلال هذه الخطوة الحضانة، يوازن عمود LS من إضافة 3 عازلة MACS مل.
11. المقبل، وغسل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة C ° 4 لمدة 5 دقائق. دورة الفتشوبتنفق الخلايا في 3 مل العازلة MACS. ماصة ثم الخلايا في العمود MACS LS فصل. تأكد لتجنب توليد فقاعات من قبل pipetting ببطء. شطف العمود بإضافة 3 مل من العازلة MACS. كرر مرتين.
12. إضافة 3 مل العازلة MACS الطازجة وإزالة عمود من المغناطيس. العمود مكان في أنبوب 15 مل المخروطية. إدراج المكبس وطرد محتويات تنقية للحصول على CD161 ^{+ +} CD3 الخلايا. عدد NKT الخلية المخصب الكسر. يجب أن يكون 2-4000000 الخلايا.

3. AAPC بوساطة توسيع NKT الخليوي

1. انشاء شارك في الثقافة من خلال إضافة 10 ^{6 +} CD3 CD161 التخصيب ⁺ الخلايا التائية و 10 AAPC ⁶ في المتوسط ​​16 مل كاملة (المتوسطة كاملة + IL-2، 100 U / مل). لوحة هذا الخليط بإضافة 160 ميكرولتر / النهائي جيدا حجم البوليسترين إلى 96 زراعة الأنسجة بشكل جيد المعالجة، U-أسفل لوحة مع تبخر منخفضة الغطاء. أداء تبادل المتوسطة كل يوم ^ال 7 عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
2. حصادالخلايا، عد، وأداء FACS تلطيخ يوم 12-14.
3. يمكن replated الموسع الخلايا NKT كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.1، على وجه التحديد إعادة تعليق 10 ⁶ خلايا T الموسع و 10 AAPC ⁶ في المتوسط ​​16 مل كاملة. لوحة هذا الخليط بإضافة 160 ميكرولتر / جيد لوحة 96 U-أسفل أيضا. تواصل تحديث المتوسطة coculture كل يوم ^ال 7 عن طريق إضافة 80 ميكرولتر من المتوسط ​​الطازجة.
4. فمن الأفضل لتجميد خلايا إضافية NKT بعد الجولة الثانية من التوسع (1 X10 ⁶ / cryovial في 1 مل DMSO-5٪ FBS 95٪ /.)

4. اختبار وظيفية: AAPC بوساطة تحفيز خلايا NKT

1. انشاء 5x10 ⁴ خلايا NKT / ⁵ AAPC بشكل جيد مع 5x10 في حجم نهائي 200 ميكرولتر (متوسطة كاملة) في 96 لوحة U-أسفل أيضا.
2. طاف الحصاد لزراعة الخلايا بعد 24-48 ساعة ELISA.

النتائج

هنا نحن تصف طريقة لتوليد CD1d-IG AAPC القائمة، التي أدلى بها توصيل التساهمية من CD1d-الإيج ومكافحة CD28 ماب لالخرز المغناطيسي لتحفيز خلايا NKT كوسيلة من وسائل موحدة لنشر خلايا NKT (الشكل 1): أولا، يجب على المرء أن تثبت أن يجمد والبروتينات الانصهار ثابت CD1d-الإيج على سطح من الخرز المغناطيسي. كما هو مبين في الشكل 2A، CD1d IG-CD28-ومكافحة وأعرب كل من الأجسام المضادة على سطح حبات المغناطيسي. دراسة القدرة تنشيطية للAAPC، ونحن الخلية NKT المشترك مع مثقف hybridomas AAPC بين عشية وضحاها، supernatants الثقافة وتحصد قياس إنتاج IL-2 بواسطة ELISA. وجدنا أن CD1d-IG مقرها AAPC كانت قادرة على تحفيز الخلايا hybridomas NKT عند مستويات مساوية أو أعلى من نظرائهم الخلوية (الشكل 3، والبيانات لا تظهر). ومن المثير للاهتمام، وجدنا أن يتم تحفيز الخلايا لدينا hybridomas الماوس NKT من AAPC CD1d الانسان ومقرها (FIجوري 2B)، الذي يوفر طريقة بسيطة لاختبار كل دفعة من AAPC.

وبعد ذلك، سعينا لإثبات إمكانية نشر AAPC، عزل الخلايا T وبالتالي الإنسان من الدم المحيطي. الأول كان CD161 ⁺ إثراء CD3 ⁺ T الخلية جزء من فصل حبة المغناطيسي. ثم، وحفز الخلايا T-α كل أسبوعين مع GalCer محملة AAPC. الأهم من ذلك، وجدنا أنه حتى مع الانخفاض النسبي الأولية سكان الخلية NKT (0.03٪)، كنا قادرين على توسيع الخلايا ل67٪ ~ Vα24 ⁺ Vβ11 ⁺ (الشكل 3). قمنا بتوسيع الخلايا NKT من PBMC العديد من المتطوعين الأصحاء ومرضى السرطان ولقد وجدت أن α-GalCer تحميل AAPC كانوا قادرين على توسيع الخلايا NKT السكان في كلا المجموعتين. وتجدر الإشارة إلى أن معدل التوسع غاية المانحة التابعة. كما هو متوقع وارتفاع عدد السكان من الخلايا الأولية ⁺ Vα24، وزيادة النسبة المئوية للتوسع. وبالإضافة إلى ذلك،عند استخدام السكان بدءا من 2 مليون خلية CD161 ^{+ +} CD3 خلايا T، يمكن للمرء أن الحصول على> 10 ⁷ الخلايا بعد جولتين من التوسع (الجدول 1). حوالي 80-90٪ من الخلايا NKT الموسع CD4 ^+، ~ 5٪ CD8 ^+، والباقي هي فرضا CD4 CD8-الخلايا المزدوج السلبية NKT. ويمكن استخدام هذه الخلايا الموسع للدراسات الفنية NKT كما هو موضح في الشكل 4A-C. لقد وجدنا أن لدينا فيفو السابقين الخلايا توسيع NKT تظل استجابة لα-GalCer التحفيز وتعتبر منتجة قوية من IL-17A، TNF-α، γ IFN و. تجدر الإشارة إلى أنه إذا الخلية الأولية T السكان منخفض التخصيب واحد غير قادر على أداء الخطوة الثانية CD161 التخصيب، وتوسيع AAPC بوساطة قد لا تسفر عن النتائج المتوقعة (انظر الشكل 4D، المانحة 1). ومع ذلك، إذا كانت النسبة المئوية للخلايا NKT المتداولة هي أعلى من 0.1٪، وينبغي للمرء أن يكون لا يزال قادرا على الحصول على توسع كبيرمن الخلايا NKT ط. بشكل جماعي، وهذه البيانات تظهر أنه يمكن استخدام CD1d القائم على AAPC بشكل فعال لتوسيع وتحفيز الخلايا الأولية الإنسان NKT.

الشكل 1. وتنصهر IG-مقرها خارج الخلية aAPCs أجزاء من جزيء CD1d إلى المنطقة المستمر لسلسلة البروتين المناعي الثقيلة مفصولة رابط قصيرة من الأحماض الأمينية: الرسم التخطيطي لCD1d. ويمكن تحميل هذه الجزيئات بسهولة مع مستضدات الدهون، مثل α-GalCer، ببساطة عن طريق احتضان لهم وجود فائض من الدهون في المصالح. وأدلى AAPC وذلك بربط CD1d-الإيج والقيمة المطلقة لمكافحة CD الخرز المغناطيسي. في هذا النظام، يتم استخدام CD1d-IG وما شابه ذلك لتوفير مستضد محددة من خلال إشارة ومكافحة CD28 TCR-ماب يوفر إشارة costimulatory.

الشكل 2. تم اختبار FACS تلطيخ من البروتينات السطحية على aAPCs A aAPCs) لوجود CD1d: مفتش ديمر (عن طريق تلطيخ مع IgG1 مكافحة الماوس PE-مترافق)، وكذلك الأجسام المضادة لمكافحة CD28 (باستخدام FITC، مترافق مكافحة الماوس IgG2a) . المدرج الاحصائي تشير المفتوح تحكم نمط إسوي؛ المدرج الاحصائي مليئة تمثل الأجسام المضادة المشار إليه. يمكن CD1d-IG AAPC تعرب عن تحفيز إنتاج IL-2 قبل خلايا NKT. B) وcocultured ^و+ Vα14 الماوس NKT خلية ورم هجين، DN32.D3، إما متوسطة، مستضد القابلة للذوبان (α-GalCer)، أو تفريغ AAPC AAPC α-GalCer محملة. تم حصادها supernatants الثقافة، وكان يستخدم معيار لقياس ELISA ساندويتش IL-2 الإنتاج.

الشكل 3. توسيع الخلايا NKT من CD1d-IG المغلفة خلايا مستضد تقديم الاصطناعي. (A) CD3 ⁺ الابتدائية CD161 ⁺ تم عزل الخلايا إيجابية مزدوجة من PBMCs باستخدام مغناطيس. وحفز الخلايا α-مصنفة مع GalCer تحميل، CD1d-IG AAPC المغلفة لمدة 14 يوما. كانت ملطخة الخلايا لتحفيز Vα24 وVβ11 AAPC التالية. (B) بوساطة الخلايا الأولية NKT الإنسان تحلل من خط الخلية اللمفاوية B. C1R-CD1d الخلايا مع الخلايا المحتضنة NKT في نسب المشار إليها في وجود أو عدم وجود مستضد، وGalCer-(100 نانوغرام / مل) في لوحات أسفل U-96-جيدا للفترة 20-24 ساعة. تم تقييم NKT الخلية بوساطة تحلل الخلايا التي قدمها مقايسة 51Cr الإفراج القياسية.

الشكل 4. ملامح من خلايا خلوى NKT-AAPC الموسعة. بعد التحفيز مع تحميل α AAPC GalCer لمدة أسبوعين، وتوسيع الخلايا NKT (1 × 10 ⁵ / أيضا) وcocultured مع ذوبان α-GalCer، سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycin، microbeads anti-CD3/28، أو α-GalCer AAPC تحميل (2 × 10 ⁵ / أيضا) لمدة 48 ساعة. (A) IL-17A، (B) TNF-α، و (C) الإنترفيرون γ تم قياس الإنتاج عن طريق ELISA خلوى القياسية. البيانات المعروضة هي صافي إنتاج السيتوكينات بعد طرح الضوابط السلبية (إدارة الإعلام والخرز فارغ). (D) T تم عزل الخلايا الأولية من PBMC باستخدام حبة الفصل المغناطيسي. وحفز الخلايا مصنفة لمدة أسبوعين مع الإشارة A-GalCer تحميل-AAPC. كانت ملطخة الخلايا باستخدام القيمة المطلقة محددة لVα24 ^{+ +} وVβ11 وتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

Discussion

ويمكن استخدام AAPC لدراسة المتطلبات الأساسية لتنشيط الخلايا NKT ولها قيمة السريرية المجراة إمكانية التوسع السابقين من الخلايا T NK لعلاج مناعي بالتبني. وصف Mescher وآخرون واحد من أنظمة الأولى استنادا حبة، حيث المعقدة البيروكسيديز الطبقة MHC I-الفئران الببتيد واحد يبني سلسلة وجنبا إلى جنب مع جزيئات costimulatory المعقدة البيروكسيديز B7.1 وB7.2 عبر streptavidin على سطح المجهرية اللاتكس ^{14 و 15.} وقد تم بنجاح هذا النهج المستخدمة لتحفيز المستضد محددة الخلايا T من الفئران المعدلة وراثيا. وبالإضافة إلى ذلك، لأن هذا النهج يستخدم احد سلسلة MHC-الببتيد المعقدة لضمان التحميل متجانسة من جزيئات MHC، فإن كل مستضد الببتيد الهدف يتطلب ترنسفكأيشن جديدة للتعبير عن المطلوب واحد مجمع الببتيد سلسلة MHC-، مما يحد من عمومية ما النهج. الأهم من ذلك، رائدة مجموعة الدكتور Schneck هو حبة القائم على AAPC، من خلال تطوير أخرى غير القائمة على حبة الخلوية AAPC، التي أدلى بها اقتران HLA-IG، إشارة 1، ومكافحة CD28، إشارة 2، على الخرز المغناطيسي. وقد وضعت HLA-IG، شكلا فريدا من multimeric HLA تنصهر إلى سقالة المناعي الجزيئي ^{16 و 17} من جماعته. بعد ذلك، أنها وضعت على أساس MHC-الإيج AAPC، والتي ثبت بشكل فعال لتوسيع CMV وMART-1 CTL محددة ^18. هنا، لقد أثبتنا التي يمكن استخدامها CD1d-IG AAPC يستند إلى توسيع الخلايا الوظيفية NKT. وقد استخدمت إحدى الدراسات نظام مماثل لدراسة التفاعل المادي للخلايا NK مع CD1d ^19.

والجدير بالذكر أن قمنا بتصميم خلية مستضد تقديم الاصطناعية التي هي قابلة للتكيف مع أي متطلبات نجد اللازمة لتكاثر الخلايا NKT الأمثل. طريقة توسيع AAPC يوفر طريقة بسيطة وموثوق بها لتوسيع وإثراء خلايا NKT. يمكن تعديل AAPC لدينا منهجية لتقييم دور لجنة من جزيئات costimulatory المحتملة وتقييم دورها في الخلية NKT proliferaنشوئها ووظيفتها. وهكذا، تمثل التكنولوجيا AAPC قوية تنوعا مفيدا لإحداث وتوسيع الخلايا NKT. توليد aAPCs تستغرق أقل من أسبوع واحد ومناسبة لإنتاج كميات كبيرة من الخرز. ومع ذلك، خطوة حاسمة في توليد AAPC هو للتأكد من أن يتم يجمد ثابت CD1d-الإيج على سطح حبات لتقييم وظائفها لضمان الاتساق من دفعة لدفعة واحدة. وجود قيود المحتملة لهذا النظام هو أنه لا يوجد آلية في مكان لإيقاف التحفيز، وغيرها من الإزالة الميكانيكية من الخرز. على وجه التحديد، وإشراك مستقبلات الخلايا T (TCR) مع المستضد: مجمع CD1d/MHC توليد عادة المشبك المناعية بالتنسيق مع الإكسسوارات / التصاق جزيئات، والتي يمكن أن تؤدي إلى تحريض من العوامل المثبطة أو الخلية القمعية على كل وT مستضد تقديم الخلايا. في نظام AAPC، قد يكون upregulated هذه العوامل من قبل خلية T، ولكن حبة لن تعبر عن يغاندس وما شابه ذلكلهذه المستقبلات.

وبالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت CD4 ⁺ الخلايا NKT لقمع ردود انتيتومور في الفئران والبشر، ولذلك فمن الممكن أن تفعيل الخلايا غير انتقائية لجميع NKT (أي التحفيز العالمية مع α-GalCer) أو تفعيل فرعية خاطئة يمكن أن يؤدي إلى المناعية غير المرغوب فيها النتائج. وبناء على ذلك، يجب على المرء ظاهريا وظيفيا تميز الخلية NKT-AAPC الموسع السكان. كما هو مبين في الشكل (4)، وجدنا أن التحفيز مع α-GalCer محملة AAPC معربا عن مكافحة CD28 يمكن أن يؤدي إنتاج خلايا NKT TH1، TH2، والسيتوكينات نوع Th17. وأفادت الدراسات أن الفئران التحدي مع IL-33، والتي تم تحديدها مؤخرا خلوى، أدى إلى زيادة مستويات تعميم السيتوكينات الالتهابية مثل IL-5 و13-IL. تعزيز العلاج للخلايا NKT مع IL-33 خلوى إنتاجها ^20. IL-33 هو يجند محددة لST2 ولقد ثبت أن ذوبان ST2 كاليفورنيان كتلة IL-33 إشارة. وهكذا، وعلى سبيل المثال لتطبيقها في المستقبل، يمكن أن تتولد AAPC ST2 التعبير عن وتستخدم لتحديد ما إذا كان يمكن للمرء أن تمنع بشكل انتقائي إنتاج السيتوكينات TH2 بينما حمل TH1 خلوى من قبل خلايا إفراز NKT. وأفيد أيضا أن حقن الرابع كيلو بايت، معربا عن AAPC في C57BL / 6 الفئران أدى إلى انخفاض الانبثاث الرئة من ²¹ الورم. الأهم من ذلك، هذه البيانات تثبت أن حركة المرور AAPC إلى الرئة، وتمكن من تنشيط الخلايا T المستجيب مجموعات فرعية. لذلك، يمكن للمرء أن تولد أنواع متعددة من AAPC ودراسة التفاعل بين مجموعات فرعية محددة مستضد الخلايا T. لتلخيص، فإن هذه الدراسات تثبت أن يمكن استخدامها CD1d-IG AAPC القائم على استبدال APC الخلوية العادية، ويجب أن القدرة على تعزيز النهج السريرية الحالية لعلاج مناعي NKT القائم على بالتبني الخلية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
Ficoll-PLUS Paque	GE العلوم الحياتية	17-1440
EasySep خلية T الإنسان التخصيب كيت	StemCell تكنولوجيا	19051
Allophycocyanin CD161 الإنسان ماب	Pharmingen	550968
EasySep المغناطيس	StemCell تكنولوجيا	18002
مكافحة الماوس IgG1 Microbeads	Miltenyi بيوتيك	130-047-101
ديمر الحادي عشر المؤتلف مثنوي ماوس قابلة للذوبان CD1d: IG انصهار بروتين	BD العلوم البيولوجية	557599
مكافحة CD28 ماب	Biolegend	302914
M-450 الخرز الايبوكسي	الحياة تكنولوجيز	150-11
ألفا galactosylceramide (KRN7000)	Axxora، LLC	BML-SL232-0100
RPMI متوسطة 1640	سيغما الدريتش	R 0883
البيروفات الصوديوم	Gibco	11360-070
غير الأحماض الأمينية الأساسية	Gibco	11140-050
فيتامين الحل	Gibco	11120-052
2-المركابتويثانول	Gibco
سيبروفلوكساسين	الكسيس الكيميائية الحيوية	380-288-G025
PE-Vα24Jα18	Biolegend	342904
PE-Vα24 (استنساخ C15)	بيكمان كولتر	A66907
FITC-Vβ11 (استنساخ C21)	بيكمان كولتر	A66905
PE-CD1d	Biolegend	123510
PE مكافحة الماوس IgG1	BD العلوم البيولوجية	556650
FITC مكافحة الماوس IgG2a	Biolegend	407105
DPBS، لا الكالسيوم، المغنيسيوم لا	الحياة تكنولوجيز	14190250
أزيد الصوديوم	سيغما الدريتش	S8032
الأبقار مصل الزلال	Bioanalytical الأمريكية	AB00440-00100
EDTA	سيغما الدريتش	431788
IL-2 (Proleukin)	BD العلوم البيولوجية	354043
الإنسان AB المصل	أتلانتا الحيوية	S40110
Labquake أنبوب الدوار	فيشر العلمية	13-687-10Q
BD 5 مل فالكون البوليسترين جولة القاع أنابيب	فيشر العلمية	14-959-1A
قوارير الزجاج ويتون عينة مع كاب	فيشر العلمية	صغيرة (03-343-6A) كبير (03-343-6E)