بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

Summary

بروتوكولات لتمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) وغالبا ما تكون وقتا طويلا وتتطلب مهارات كبيرة ثقافة الخلية. هنا، تكيفنا صغيرة الداخلي القائم على التمايز جزيء إلى تنسيق وحة multititre، مما يسمح للجيل بسيطة وسريعة، وفعالة من الخلايا العصبية الإنسان في الطريقة التي تسيطر عليها.

Abstract

البروتوكولات القائمة لتوليد الخلايا العصبية البشرية من الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) وغالبا ما تكون مملة في أن تكون إجراءات متعددة الخطوات التي تنطوي على العزل والتوسع في الخلايا العصبية السلائف، قبل التمايز النهائي. بالمقارنة مع هذه النهج تستغرق وقتا طويلا، وجدنا مؤخرا أن تثبيط مجتمعة من ثلاثة مسارات الإشارات، TGFβ/SMAD2، BMP/SMAD1، وجمعية جيل المستقبل / ERK، ويعزز الحث السريع في الأديم الظاهر العصبي من hPSCs، تليها تمايز الخلايا العصبية فوري في وظيفية. هنا، تكيفنا إجراءاتنا إلى تنسيق رواية وحة multititre، لزيادة تعزيز وتكرار لجعلها متوافقة مع منتصف الإنتاجية التطبيقات. وهي تتألف من أربع أيام من تشكيل الأديم الظاهر العصبي في مجالات العائمة (الهيئات مضغي الشكل)، تليها أربعة أيام مزيد من التمايز في الخلايا العصبية في ظل ظروف ملتصقة. معظم الخلايا التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول ويبدو أن الخلايا العصبية الحسية الثنائي القطب. وعلاوة على ذلك،هذا الإجراء هو ذات كفاءة عالية، لا تتطلب مهارات خاصة الخبراء، ويستند إلى وسيلة بسيطة محددة الصفات كيميائيا مع فعالة من حيث التكلفة جزيئات صغيرة. بسبب هذه الميزات، قد الإجراء بمثابة منصة مفيدة لتحقيق مزيد الفنية وكذلك لخلية القاعدة التي تتطلب فحص الخلايا العصبية الحسية يقترب الإنسان أو الخلايا العصبية من أي نوع.

Introduction

hPSCs، تضم الجنين المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (hiPSCs)، هي معنى المحفزة التي يمكن أن تؤدي إلى خلية مختلف الأنساب في المختبر ^1-2. وقد استمدت العديد من أنواع الخلايا المتمايزة من hESCs حتى الآن، مما يدعم فكرة أن هذه الخلايا تقديم أدوات قيمة للبحث العلمي والنهج القائم على الفحص الخلية، وتبشر الخلايا المستندة إلى التداوي.

بروتوكولات تمايز الخلايا العصبية لوعادة ما تكون معقدة hESCs ومضيعة للوقت وتعتمد في كثير من الأحيان على مصير عموما لأول حمل العصبية، تليها عزلة دليل من الأسلاف العصبية، والتمايز النهائي لاحقة إلى نوع معين من الخلايا العصبية الفائدة ^3-6. في بعض الصدد، هذا التعقيد ليس من المستغرب وحتمية بالنظر إلى أن مثل هذه الدولة من بين الفن بروتوكولات توجيه التمايز التدريجي تميل إلى تقليد التنمية البشرية في وقت مبكر، حركتيح هو في حد ذاته في غاية التعقيد. من ناحية أخرى، قد يكون في جزء تعكس أيضا افتقارنا إلى فهم العمليات الجزيئية الكامنة، مما أدى إلى تمايز البروتوكولات التي لا تزال بعيدة عن الأمثل تماما.

فيما يتعلق بتحويل hPSCs غير متمايزة في الأديم الظاهر العصبي، بيرا وآخرون. وجدت أن قمع BMP / SMAD1/5/8 الإشارات العصبية من تحريض يعزز hESCs ^7. وعلاوة على ذلك، فقد تبين من تعطيل SMAD2 / 3 إشارات لتعزيز تشكيل الأديم الظاهر العصبي ^8. وبناء عليه، تعطيل الجمع بين هذه المسارات من 2 يميل إلى أن يؤدي إلى تحريض العصبية أكثر كفاءة من hPSCs ^4،9. وفي الآونة الأخيرة، وقد أظهرت لنا أن مسار الإشارات الثالث، FGF / ERK، بمثابة كاظمة قوية من أقرب الخطوات التزام عصبي في hESCs. وعلى العكس، القمع المتزامن لجميع المسارات الثلاثة هذه تؤدي إلى شبه متجانسة تحويل hESCs في الأديم الظاهر العصبي معفي الأيام الأربعة فقط ^10. بعد ذلك، لوحظ كفاءة عالية التمايز إلى خلايا عصبية طرفية وظيفية في غضون ثمانية أيام. وكانت الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من المرجح أن تكون الخلايا العصبية الحسية في الجهاز العصبي المحيطي، والتي قد تساهم جزئيا في تفسير اشتقاقها السريع ^10. ويعتبر وجود عيوب في الصيانة الخلايا العصبية الحسية سببا للاضطرابات بشرية معينة مثل خلل الوظائف المستقلة العائلية ^11. لنمذجة هذه الأمراض يعتمد على التكنولوجيا hiPSC ^12، لتوصيف وظيفي أخرى، وكذلك لأغراض تطبيق لا تتطلب أي نوع معين من الخلايا العصبية، قد يكون هذا الإجراء التمايز تقديم أساسا مفيدا.

ومع ذلك، أدت استراتيجية التمايز استخدمناها في الأصل تشكيل الهيئات المعنية الجنينية (EBS) من كتل من المستعمرات hESC ^10، وهذا في درجة لا بأس به من عدم التجانس فيما يتعلق بأحجام EB، وأيضا ظهرت لتقديم تنازلات الخلايا العصبية في بعض الكفاءة تشكيل مليرة لبنانية خطوط. وعلاوة على ذلك، ونظرا لعدم التجانس في أحجام EB، يبدو أن القدرة على اختبار منهجية آثار عوامل النمو إضافية أو جزيئات صغيرة أثناء وبعد تشكيل الخلايا العصبية ليكون مرتبك بعض الشيء.

في هذا التقرير، وتكييفها ونحن لدينا الإجراء السابق إلى وسيلة الإنتاجية المتوافقة مع تقنية التجميع على أساس أجبروا على توليد EBS بطريقة حجم تسيطر عليها إلى حد كبير، كما هو مبين أيضا في سياقات أخرى ^13. وبعد ذلك، EBS ولدت في الخامس على شكل لوحات الآبار 96-جيدا ونقل إلى مرفق منخفضة للغاية على شكل U 96-وحات جيدة، لبدء تشكيل الأديم الظاهر العصبي في التعليق. بعد أربعة أيام، يمكن أن يصفح عن EBS من الخلايا العصبية مما يؤدي إلى التمييز في شفائهم عالية الكفاءة والتجانس. بدلا من ذلك، كانت يوم EBS-4 فصلها إلى خلايا واحد ومطلي من هذا النحو، مما أدى إلى انخفاض الكثافة monolayers من الخلايا العصبية البشرية. وبالتالي النتائج التي تم الحصول عليها حتى الآن متماسكة مع دي مستقل 2خطوط hESC rived، وHuES6 NCL3.

كشرط مسبق، كانت ناجحة تشكيل EB تعتمد بشكل صارم على استخدام البوليمر الاصطناعية، وبولي فينيل الكحول (PVA)، جنبا إلى جنب مع مثبط ROCK Y-27632 المعروفة لتعزيز بقاء hESC ^13-14. وتعززت بشكل كبير نتيجة لذلك، تجانس EBS التي تشكلت في 96-V-لوحات مقارنة تشكيل EBS، لأن الحضارات الشامل على أساس تقنيات تقسيم عشوائي. هذا النظام يوفر بالتالي منصة تحسنت بشكل ملحوظ عن تشكيل الأديم الظاهر العصبي في الثقافة التعليق، تليها تشكيل الخلايا العصبية تسيطر عليها في ظل ظروف غاية ملتصقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد Matrigel المغلفة لوحات وسائل الإعلام

1. وقد وجد إعداد لوحات Matrigel Matrigel المغلفة لتكون ركيزة المفضل لمرفق التفرقة EBS وتعزز أيضا ثمرة كفاءة الخلايا العصبية من هذه ^10.
   1. تحسن 10 مل من Matrigel بين عشية وضحاها على الجليد.
   2. اليوم التالي، تمييع الهلام مثل Matrigel مع مجلدين من الجليد الباردة DMEM/F-12 وإعداد مأخوذة من 1 مل مل في أنابيب prechilled المخروطية ال 15 التي يمكن تخزينها في -20 درجة تجمد C.
   3. البت شكل لوحة للتمايز الخلايا العصبية. على سبيل المثال، كنقطة انطلاق، نوصي لإجراء الجولة الأولى من تمايز في شكل 12-أيضا. قبل باردة 4 12-وحات جيدة في C. ° 4 حل 1 قسامة من Matrigel المجمدة عن طريق إضافة 9 مل من قبل المبردة DMEM/F-12 تليها pipetting صعودا وهبوطا حتى كل Matrigel prediluted وإذابة والمنحل.
   4. ثمونقل المحتويات إلى أنبوب جديد 50 مل تحتوي على 15 مل من DMEM/F-12 على الجليد (النهائي Matrigel التخفيف: 1:75). ثم، إضافة 0.5 مل من المخفف Matrigel إلى كل بئر من لوحات 12-جيدا قبل المبردة. لوحات التفاف مع Parafilm واسمحوا الوقوف بين عشية وضحاها في RT.
   5. اليوم التالي، نقل إلى لوحات C. ° 4 ويمكن تخزين لوحات مغلفة لعدة أسابيع قبل الاستخدام.
2. وسائل الإعلام

EB المتوسطة تشكيل (~ 15 مل اللازمة لأداء التمايز في لوحة واحدة 96-جيدا - انظر الجدول (1) ومخطط في الشكل 2):
DMEM/F-12 مع 0.4٪ (PVA)
1X N2
1X B27
0.05٪ BSA
20 نانوغرام / مل FGF2
10 ميكرومتر Y-27632
1X PenStrepGln

متوسطة التمايز (~ 30 مل اللازمة لأداء التمايز في لوحة واحدة 96-حسنا، تليها تشكيل الخلايا العصبية في لوحة واحدة 12-Matrigel المغلفة جيدا، انظر الجدول 1):
DMEM/F-12
1X N2
1X B27
0.05٪ BSA
0.5 ميكرومتر PD0325901
SB431542 ميكرومتر 15
0.5 ميكرومتر Dorsomorphin
1X PenStrepGln

2. اضطر EB تشكيل

1. تنمو في ظل ظروف hPSCs الخاص المغذية خالية المفضل. نستخدم MEF مكيفة المتوسطة على لوحات 6 Matrigel المغلفة جيدا ^15. ومع ذلك، ينبغي لنظم أخرى مثل الثقافة أو تجارية محلية الصنع وسائل الإعلام تعريف العمل أيضا. في وقت بدء تجربة التمايز، يجب أن يكون hPSCs شبه متموجة وبنشاط متزايد.
2. إزالة المستعمرات ميكانيكيا بشكل عفوي متباينة باستخدام ماصة معقمة تلميح البلاستيك تحت المجهر ستيريو.
3. غسل المستعمرات غير متمايزة المتبقية باستخدام PBS، وهضم للخلايا التي تحتوي على واحد باستخدام Accutase 1X Y-27632. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي واحد في 200 x ج لمدة 2 دقيقة، resuspend في وحدة تخزين صغيرة من تشكيل EB المتوسطة وتحديد عيار الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
4. إضافة إلى قسامة من الخلاياتشكيل EB المتبقية المتوسطة أن يؤدي إلى ما بين 40،000 عيار و 80،000 خلية لكل مل.
5. باستخدام ماصة الأقنية، نقل 100 ميكرولتر لكل بئر لوحة 96V القاع، مما أدى إلى 8،000 في 4،000 خلايا لكل بئر. تدور بشكل جيد 96-وحة لوحة أجهزة الطرد المركزي في أرجوحة المغادرة في 400 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الخلايا في أسفل الآبار، ونقل إلى الخلية الحاضنة الثقافة. سوف تشكل EBS بين عشية وضحاها، كما هو مبين في الشكل 1.

3. الأديم الظاهر العصبي الحث

1. اليوم التالي (يوم 0)، وجمع من EBS وحة 96V تحت المجهر ستيريو، ونقل في وحدة تخزين صغيرة في طبق البكتيرية التي تحتوي على 3.5 سم 2 مل من المتوسط ​​التمايز. تستنهض الهمم بلطف طبق لعدة ثوان لغسل EBS.
2. إضافة 100 ميكرولتر من تمايز المتوسطة لكل بئر من أسفل-U-البالغة الانخفاض المرفقات 96-وحة جيدا. تحت stereomicroscope، EBS نقل كميات صغيرة في طبق الغسيل من 96U في الآبار (واحد لكل EB نحنليرة لبنانية). لوحة 96U مكان في الخلية الحاضنة الثقافة لمدة 4 أيام للسماح بتشكيل الأديم الظاهر العصبي.

4. الخلايا العصبية تشكيل

1. في يوم 4، إعداد طبق الغسيل كما في الخطوة 3.1 و استبدال بالإضافة إلى ذلك DMEM/F-12 في لوحة قبل تحسنت 12-Matrigel المغلفة جيدا بواسطة متوسطة التمايز (1 مل لكل بئر).
2. الطلاء من EBS
   1. جمع EBS من لوحة 96U، وغسل هذه البذور على النحو الوارد أعلاه، وبعناية واحدا تلو الآخر في بئر من لوحة 12-Matrigel المغلفة جيدا (حوالي 8 EBS لكل بئر): يجب EBS موزعة بالتساوي داخل الآبار للسماح ثمرة من دون عائق الخلايا العصبية خلال الأيام القليلة المقبلة (انظر "اليوم 5" الصورة في الشكل 2).
   2. قبل نقل الجزء الخلفي لوحة 12-جيدا في الحاضنة، والسماح لEBS إرفاق فضفاضة لحوالي 10 دقيقة في RT. ثم، بعناية نقل 12-وحة جيدا إلى الخلية الحاضنة الثقافة. سوف تنمو الخلايا العصبية الخروج من EBS مطلي بطريقة شعاعي داخل 4 أيام القادمة، كما SHOWN في الشكل 2 ("يوم 8" الصورة على اليمين).

5. الخلايا العصبية وتشكيل Monolayers

1. كبديل للخطوات النقطة 4)، في يوم 4 من هذا الإجراء، جمع EBS في طبق البكتيرية التي تحتوي على 3.5 سم 2 مل من المتوسط ​​التمايز، ثم نقل EBS في حجم صغير لطبق PBS المحتوية على، ومن ثم إلى طبق آخر يحتوي على Accutase.
2. السماح لخلايا الهضم واحدة، الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة، resuspend في وحدة تخزين صغيرة من متوسطة التمايز وتحديد عيار الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ضبط عيار إلى الخلايا ⁶ 1-2X10 لكل مل باستخدام المتوسطة التمايز (بدون Y-27632).
3. لوحة الخلايا في مرحلة ما قبل حرارة 12-وحة Matrigel المغلفة جيدا (1 مل لكل بئر)، ونقل إلى الخلية الحاضنة الثقافة. ولوحظ تشكيل الخلايا العصبية كما monolayers بين 7 أيام إلى 8 (الشكل 3C). وتجدر الإشارة، مع ذلك، أن هذا البديل أحادي الطبقة منلم يتم إجراء الأمثل تماما فيما يتعلق بقاء الخلية والركيزة أكثر ملائمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في تقريرنا السابق، وذلك تمشيا مع العديد من الآخرين، يمكن أن تتولد من EBS hPSCs ببساطة عن طريق replating المجاميع على تقسيم الروتيني للhPSCs في المرفقات أطباق منخفضة ^10. هذه النتائج عادة في توزيع واسعة من الأحجام EB الناتجة (الشكل 1C، أعلى). مشكلة أخرى تنتج عن ذلك هو أ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وتستند معظم البروتوكولات التي تنطوي على تمييز تشكيل EB من hPSCs، بما في ذلك إجراء نشرت سابقا لدينا ^10، على الخط أو بمساعدة إنزيم حصاد hESCs والمجاميع، الأمر الذي يؤدي حتما إلى عدم التجانس في أحجام EB. هذه الحقيقة يؤدي إلى التباين في كفاءة تمايز مع بعض خطوط الخلايا، مما ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
Matrigel HC	بيكتون ديكنسون	354263	انظر النص للحصول على تفاصيل حول التعامل مع
DMEM/F-12	الحياة تكنولوجيز	21331-020
بولي (فينيل الكحول)	سيجما	363170	حل عند 0.4٪ في DMEM/F-12 باستخدام الموجات فوق الصوتية بالحمام المائي / تجنب ارتفاع درجة الحرارة / يمكن أن تظل في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع
N2 الملحق	الحياة تكنولوجيز	17502-048	100X، وتخزين مأخوذة المجمدة
B27 الملحق	الحياة تكنولوجيز	12587-010	50X، المخزن كما مأخوذة المجمدة
الأبقار مصل الزلال	سيجما	A1595	10٪ = 500X، المخزن كما مأخوذة المجمدة
الجلوتامين L-البنسلين / الستربتوميسين	PAA	P11-013	أو ما يعادلها
FGF2	Peprotech	100-18B	حل في 10 ميكروغرام / مل في 0.1٪ BSA / PBS = 1000X، المخزن كما مأخوذة المجمدة
ROCK المانع Y-27632	abcamBiochemicals	ASC-129	حل بنسبة 10 ملم في DMSO = مخزن، كما 1000X مأخوذة المجمدة
PBS	PAA	H15-002	أو ما يعادلها
Accutase	PAA	L11-007
96-V-أسفل جيدا لوحات	نونك	277143
PD0325901	محور عصبي Medchem	محور عصبي 1408	حل عند 0.5 ملم في DMSO = مخزن، كما 1000X مأخوذة المجمدة
SB431542	abcamBiochemicals	ASC-163	حل في 15 ملم في DMSO = مخزن، كما 1000X مأخوذة المجمدة
Dorsomorphin	سانتا كروز	SC-200689	حل عند 0.5 ملم في DMSO = مخزن، كما 1000X مأخوذة المجمدة
96-U-أسفل جيدا لوحات المرفقات منخفضة للغاية	كورنينج	7007
بيتا-III الأجسام المضادة تويولين (الماوس)	سيجما	T8660	استخدام في 1:1000
بيتا-III تويولين الأجسام المضادة (ارنب)	كوفانس	PRB-435P	استخدام في 1:2000
BRN3A (POU4F1) الأجسام المضادة	سانتا كروز	SC-8429	استخدام في 1:500
			الجدول 1. </ STRONG> الكواشف محددة والمعدات.