Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты

Резюме

Протоколы для нейрональной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs), часто отнимает много времени и потребует значительных навыков культуры клеток. Здесь мы адаптировали небольшая молекула на основе дифференциации процедуры в формат пластин multititre, позволяющий простым, быстрым и эффективным поколения человеческие нейроны в управляемом режиме.

Аннотация

Существующие протоколы для генерации нейроны из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), часто утомительной в том, что они многоступенчатой ​​процедуры, связанные с выделением и расширением нейронных клеток-предшественников, до терминальной дифференцировки. По сравнению с этим трудоемким подходы, недавно мы обнаружили, что комбинированное торможение тремя сигнальными путями, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, и FGF / ERK, способствует быстрой индукции нейроэктодермы от hPSCs, с последующим немедленным дифференциации в функциональные нейроны. Здесь мы адаптировали нашу процедуру новый формат пластин multititre, дальнейшего повышения ее воспроизводимости и сделать его совместимым с середины пропускная способность приложений. Она включает в себя четыре дня нейроэктодермы образование в плавающих сфер (эмбриоидных органов), а затем еще четыре дня дифференциацию в нейроны под приверженцем условиях. Большинство клеток, полученных с помощью этого протокола, кажется, биполярное сенсорных нейронов. Кроме того,Процедура очень эффективна, не требует особых навыков эксперта, и основан на простом химически определенной среде с экономичным малых молекул. Благодаря этим особенностям, процедура может служить полезной платформой для дальнейшего функционального расследования, а также для клеточного скрининга приближается требующих человеческих сенсорных нейронов или нейронов любого типа.

Введение

hPSCs, включая эмбрионов, полученных человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), являются плюрипотентных смысле, что они могут дать повод для разных линий клеток в лабораторных условиях ^1-2. Многочисленные дифференцированных типов клеток были получены из ЭСК на сегодняшний день, подтверждая мнение, что эти клетки представляют ценный инструмент для научных исследований и клеточных подходов скрининга, а также перспективны для клеточной терапии.

Нейронные протоколов дифференциации ЭСК, как правило, сложный и трудоемкий, поскольку они часто основаны на первом вызывающие общий нервный судьбы, после чего руководство изоляции нейронных предшественников, и последующей дифференциации терминал в данном нейроне типа интересом ^3-6. В некоторых связи, эта сложность не удивительно и неизбежным, учитывая, что такое государство-оф-искусство направлены протоколы дифференциации, как правило, поэтапно имитировать раннее развитие человеческого потенциала, whicч само по себе чрезвычайно сложно. С другой стороны, оно может частично отражать наше отсутствие понимания основных молекулярных процессов, в результате дифференциации протоколов, которые еще далеко не полностью оптимизирована.

Что касается превращения недифференцированных hPSCs в нейроэктодермы, Пера и соавт. Установлено, что подавление BMP / SMAD1/5/8 сигнализации повышает нейронной индукции ЭСК ^7. Кроме того, инактивация SMAD2 / 3 сигнализация была показана способствовать формированию нейроэктодермы ^8. Соответственно, в сочетании инактивации этих двух путей имеет тенденцию приводить к более эффективному нейронной индукции hPSCs ^4,9. Совсем недавно, мы показали, что третий сигнальный путь, FGF / ERK, служит сильным репрессор из первых шагов обязательства нейроэктодермальных в ЭСК. С другой стороны, одновременное подавление всех этих трех путей приводит к почти однородным преобразованием ЭСК в нейроэктодермы свсего за четыре дня ^10. Впоследствии, высокоэффективных терминальной дифференцировке в функциональные нейроны наблюдалось в течение восьми дней. Нейроны были получены, вероятно, будет сенсорных нейронах периферической нервной системы, которое может частично объяснить их быстрого вывода ^10. Дефекты в сенсорных нейронов обслуживания считается причиной некоторых болезней человека, таких как семейные Dysautonomia ^11. Для моделирования таких заболеваний, основанный на технологии hiPSC ^12, для дальнейшего функциональные характеристики, а также для прикладных целей, не требующих особого типа нейронов, эта дифференциация процедуры могут представлять собой полезную основу.

Тем не менее, стратегия дифференциации мы изначально занято участвуют формирования эмбриональных органов (ЭТ) от скопления колоний ЭСК ^10, и это привело к довольно степень неоднородности в отношении EB размеров, а также появилась на компромисс нейрона эффективности формирования в некоторых сеLL линий. Кроме того, из-за неоднородности в размерах EB, способность к систематическому проверить эффекты дополнительных факторов роста или малых молекул, во время и после формирования нейронов, казалось, несколько сбит с толку.

В этом докладе мы адаптировали нашу предыдущую процедуру для средней пропускной совместимы, вынуждены агрегации на основе техники для создания ЭТ в высшей степени размер контролируемой форме, а также показаны в других контекстах ^13. Впоследствии ЭТ генерируется в V-формы лунки 96-луночных были переданы в П-образной ультра-низким вложений 96-луночные планшеты, инициировать нейроэктодермы образование в суспензии. Четыре дня спустя, ЭТ может быть высевают что приводит к терминально дифференцированные нейроны с высокой эффективностью и однородностью. Кроме того, день-4 ЭТ были распадается на отдельные клетки и высевают, как такие, в результате которых низкой плотности монослоя человеческих нейронов. Когерентные результаты были получены до сих пор с двумя независимыми де-rived линий ЭСК, HuES6 и NCl3.

В качестве предпосылки, успешное формирование EB было строго зависит от использования синтетических полимеров, поливинилового спирта (ПВС), вместе с рок-ингибитор Y-27632 известно, способствуют выживанию чЭСК ^13-14. В результате, однородность ЭТ формируется в 96-V-пластины были существенно расширены по сравнению с формирования ЭТ как массовое культур на основе случайных методов расщепления. Эта система обеспечивает, таким образом значительно улучшить платформу для нейроэктодермы образование в суспензионной культуре, а затем строго контролируемых нейронов при формировании приверженцем условиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Matrigel покрытие пластин и СМИ

1. Подготовка Matrigel покрытием Matrigel пластины были найдены, чтобы быть предпочтительным субстратом для прикрепления дифференциации ЭТ, а также способствует эффективному вырост нейронов из этих ^10.
   1. Оттепель 10 мл Matrigel ночь на льду.
   2. На следующий день, развести желеобразной Matrigel с двумя объемами ледяной DMEM/F-12 и подготовить аликвоты по 1 мл в prechilled 15 мл конические пробирки, которые могут храниться замороженными при -20 ° C.
   3. Решают на пластину формата дифференцировку нейронов. Например, в качестве отправной точки, мы рекомендуем выполнить первый раунд дифференциации в 12-луночный формат. Предварительно прохладно четыре 12-луночных планшетах при 4 ° C. Растворите одну аликвоту замороженных Matrigel путем добавления 9 мл предварительно охлажденного DMEM/F-12 затем с помощью пипетки вверх и вниз, пока все разведенного Matrigel оттаивания и растворяют.
   4. Затем, Передавать содержимое в новый 50 мл пробирку, содержащую 15 мл DMEM/F-12 на льду (конечное разведение Matrigel: 1:75). Затем добавить 0,5 мл разведенной Matrigel в каждую лунку предварительно охлажденные 12-луночных планшетах. Оберните пластин с Parafilm и дать постоять при комнатной температуре в течение ночи.
   5. На следующий день, передавать пластин до 4 ° C. Покрытые пластины можно хранить в течение нескольких недель перед использованием.
2. Средства массовой информации

EB формирования среднего (~ 15 мл, необходимых для выполнения дифференциации в одном 96-луночный планшет - см. таблицу 1 и схему на рисунке 2):
DMEM/F-12 с 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 нг / мл FGF2
10 мкм Y-27632
1x PenStrepGln

Дифференциация среднего (~ 30 мл, необходимых для выполнения дифференциации в одном 96-луночный планшет с последующим формированием нейрона в одной Matrigel покрытые 12-луночный планшет, см. таблицу 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% BSA
0,5 мкМ PD0325901
15 SB431542 мкМ
0,5 мкМ Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Принудительное EB Формирование

1. Расти hPSCs под нужный фидерных свободных условиях. Мы используем MEF-кондиционированной среды на матригеле покрытием 6-луночных планшетах ^15. Тем не менее, другие системы культуры, такие как домашние или коммерческие определены средства массовой информации также должны работать. На момент начала эксперимента дифференциации, hPSCs должна быть суб-вырожденная и активно растет.
2. Механически удалить спонтанно дифференцировать колонии, используя стерильный пластиковый наконечник пипетки под стерео микроскоп.
3. Вымойте оставшиеся недифференцированные колонии использованием PBS, и дайджест на одной клетки, используя Accutase 1X содержащие Y-27632. Пелле отдельных клеток путем центрифугирования при 200 мкг в течение 2 мин, ресуспендируют в небольшом объеме EB среднего формирования и определить титр клетки помощью гемоцитометр.
4. Добавить аликвоты клетокостальные средние формирования EB привести к титр между 40000 и 80000 клеток на мл.
5. С помощью многоканальной пипетки, передавать 100 мкл на лунку для 96V-нижняя плита, в результате чего 4000 до 8000 клеток на лунку. Спин 96-луночный планшет в свинг-из тарельчатой ​​центрифуге при 400 мкг в течение 1 мин, чтобы собрать клетки в нижней части скважины, и передать культуру клеток инкубатора. ЭТ образуют одну ночь, как показано на рисунке 1.

3. Нейроэктодермы индукционные

1. На следующий день (день 0), собирать ЭТ от 96V пластины под стерео микроскопа и передаче в небольшом объеме в 3,5 см бактериальной блюдо, содержащий 2 мл дифференциации среды. Аккуратно перемешивать блюдо в течение нескольких секунд, чтобы вымыть EB.
2. Добавить 100 мкл дифференциации среды в скважине ультра-низким вложение U-дно 96-луночный планшет. В стереомикроскопа, передача ЭТ в небольших объемах из стиральной блюдо в 96U скважин (одна EB за намиLL). Место 96U пластины в культуре клеток инкубаторе в течение 4 дней, чтобы нейроэктодермы образования.

4. Нейрон Формирование

1. На 4-й день, подготовить стиральную блюдо, как в шаге 3.1 и дополнительно заменить DMEM/F-12 в предварительно нагретой Matrigel покрытые 12-луночный планшет дифференциация среды (1 мл на лунку).
2. Покрытие из ЭТ
   1. Сбор ЭТ от 96U плиты, мыть этим, как указано выше, и тщательно семя их по одной в лунки Matrigel покрытые 12-луночный планшет (около 8 ЭТ на лунку): EBS должны быть равномерно распределены в пределах скважины, чтобы спокойно следствием нейронов в течение ближайших дней (см. "5-й день" Изображение на рисунке 2).
   2. До передачи на 12-луночный планшет обратно в инкубатор, позволяют ЭТ в свободно закрепить около 10 минут при комнатной температуре. Затем осторожно переносить 12-луночный планшет для культуры клеток инкубатора. Нейроны будет расти из покрытием ЭТ в радиальном порядке в течение следующих 4 дней, а шоWn на рисунке 2 ("8-й день" изображение справа).

5. Нейрон формирование в виде монослоев

1. В качестве альтернативы шаги пункт 4), на 4 день процедуры, собирать ЭТ в 3,5 см бактериальной блюдо, содержащий 2 мл дифференциации среднего, а затем передать ЭТ в небольшом объеме PBS-содержащих блюдо, а затем в другое блюдо, содержащее Accutase.
2. Пусть переварить в одиночных камерах, центрифуги при 200 мкг в течение 2 мин, ресуспендируют в небольшом объеме дифференциации среднего и определить титр клетки помощью гемоцитометр. Отрегулируйте титры к 1-2х10 ⁶ клеток на мл, используя дифференциацию среды (без Y-27632).
3. Пластина клеток в предварительно нагретой Matrigel покрытые 12-луночный планшет (1 мл на лунку), и переход к культуре клеток инкубатора. Нейрон образование в виде монослоев наблюдается между днями 7 до 8 (рис. 3С). Следует отметить, однако, что этот монослой вариантПроцедура не полностью оптимизирована по отношению к выживаемости клеток и наиболее подходящим субстратом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В нашем предыдущем докладе, в соответствии с многими другими, EBS от hPSCs может быть создан просто replating агрегатов на рутину расщепления hPSCs в низких вложений блюда ^10. Это обычно приводит к широкому распространению в результате EB размеров (рис. 1С, вверху). Еще одна проблема, в ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Большинство дифференциация протоколы с участием EB образования из hPSCs, в том числе наших ранее опубликованных процедуры ^10, основаны на ручном или фермента при содействии уборки ЭСК в виде агрегатов, что неизбежно приводит к неоднородности в EB размеров. Этот факт приводит к изменчи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	См. текст подробности по обращению
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Поли (виниловый спирт)	Сигма	363170	Растворить в 0,4% в DMEM/F-12 с помощью ультразвукового водяной бане / во избежание перегрева / можно хранить при температуре 4 ° C в течение нескольких недель
Дополнение N2	Life Technologies	17502-048	100X, хранить как замороженные аликвоты
B27 дополнения	Life Technologies	12587-010	50X, магазина, как замороженные аликвоты
Бычьего сывороточного альбумина	Сигма	A1595	10% = 500X, хранить как замороженные аликвоты
L-глютамин с пенициллина / стрептомицина	PAA	P11-013	Или эквивалент
FGF2	Peprotech	100-18B	Растворите в концентрации 10 мкг / мл в 0,1% BSA / PBS = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
ROCK ингибитор Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Растворить в 10 мМ в ДМСО = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
PBS	PAA	H15-002	Или эквивалент
Accutase	PAA	L11-007
96-и V-днища	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Растворить в 0,5 мМ в ДМСО = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	растворяют в 15 мМ в ДМСО = 1000X, хранить как замороженные аликвоты
Dorsomorphin	Санта-Крус	SC-200 689	растворяют в 0,5 мМ в ДМСО = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
96-луночные U-нижний ультра-низким пластин вложения	Гранулирование	7007
Бета-III тубулина антитело (мышь)	Сигма	T8660	использовать при 1:1000
Бета-III тубулина антителами (кролик)	Covance	PRB-435P	использовать при 1:2000
BRN3A (POU4F1) антитела	Санта-Крус	SC-8429	использовать при 1:500
			Таблица 1. </ STRONG> Специальные реагенты и оборудование.