Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Riepilogo

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Abstract

Protocolli esistenti per la generazione di neuroni da cellule staminali pluripotenti (hPSCs) sono spesso noioso in quanto sono procedure multistep coinvolgono l'isolamento e l'espansione di cellule precursori neurali, prima differenziazione terminale. In confronto a questi approcci in termini di tempo, abbiamo recentemente scoperto che l'inibizione combinata di tre vie di segnalazione, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promuove la rapida induzione neuroectoderma da hPSCs, seguita da immediata differenziazione in neuroni funzionali. Qui, abbiamo adattato la nostra procedura per un nuovo formato di piastra multititre, per migliorare ulteriormente la sua riproducibilità e di renderlo compatibile con metà del throughput delle applicazioni. Esso si articola in quattro giorni di formazione neuroectoderma in sfere galleggianti (corpi embrionali), seguito da altri quattro giorni di differenziamento in neuroni in condizioni aderenti. La maggior parte delle cellule ottenute con questo protocollo sembrano essere i neuroni sensoriali bipolari. Inoltre,la procedura è altamente efficiente, non richiede particolari competenze esperte, e si basa su un mezzo chimicamente definito semplice con piccole molecole costo-efficienti. A causa di queste caratteristiche, la procedura può servire come piattaforma utile per un'ulteriore indagine funzionale così come per la cella di screening avvicina richiedendo umani neuroni sensoriali o neuroni di qualsiasi tipo.

Introduzione

hPSCs, composto da embrioni derivati ​​da cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono pluripotenti significato che possono dare origine a diverse linee cellulari in vitro ^1-2. Numerosi tipi di cellule differenziate sono stati derivati ​​da hESC ad oggi, sostenendo l'idea che queste cellule presentano strumenti utili per la ricerca scientifica e basati su celle approcci di screening, e promettenti per terapie a base di cellule.

Protocolli per la differenziazione neuronale hESC sono solitamente complesse e lunghe quanto sono spesso basati sulla prima sorte indurre complessiva neurale, seguito da isolamento manuale dei progenitori neurali, e la differenziazione terminale successiva in un determinato tipo di neurone di interesse ^3-6. In alcuni riguardo, questa complessità non è sorprendente e inevitabile dato che un tale state-of-the-art protocolli di differenziazione diretti tendono a imitare graduale primi stadi dello sviluppo umano, which è di per sé estremamente complesso. D'altra parte, può in parte anche riflettere la nostra mancanza di comprensione dei processi molecolari sottostanti, con conseguente protocolli di differenziazione che sono ancora lungi dall'essere completamente ottimizzato.

Per quanto riguarda la conversione di hPSCs indifferenziate in neuroectoderma, Pera et al. trovato che la soppressione di BMP / SMAD1/5/8 segnalazione aumenta l'induzione neurale del hESC ^7. Inoltre, l'inattivazione di SMAD2 / 3 segnalazione ha dimostrato di promuovere la formazione neuroectoderma ^8. Di conseguenza, l'inattivazione combinata di queste due vie tende a generare una più efficace di induzione neurale del hPSCs ^4,9. Più di recente, abbiamo dimostrato che un percorso di segnalazione terzo, FGF / ERK, funge da repressore forte delle prime fasi di impegno neuroectodermica in hESC. Al contrario, la repressione simultanea di tutti e tre questi percorsi portare a quasi omogenea conversione di hESC in neuroectoderma conin soli quattro giorni ^10. Successivamente, la differenziazione terminale altamente efficiente in neuroni funzionali è stato osservato entro otto giorni. I neuroni ottenuti sono stati probabilmente i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico, che può in parte spiegare la loro derivazione rapida ^10. Difetti nella manutenzione neurone sensoriale è considerata una causa di alcune patologie umane come disautonomia familiare ^11. Per la modellazione di tali malattie basato su tecnologia hiPSC ^12, per un'ulteriore caratterizzazione funzionale, nonché per scopi applicati non richiedono alcun tipo particolare di neuroni, questa procedura differenziazione può presentare una base utile.

Tuttavia, la strategia di differenziazione che avevamo originariamente impiegato coinvolto formazione di corpi embrionali (EB) da ciuffi di colonie hESC ^10, e ciò ha determinato un bel grado di eterogeneità per quanto riguarda formati EB, e apparso anche di compromettere l'efficienza formazione dei neuroni in alcune ceLinee ll. Inoltre, a causa della eterogeneità in dimensioni EB, la possibilità di verificare sistematicamente effetti dei fattori di crescita addizionali o piccole molecole durante e dopo la formazione dei neuroni sembravano essere alquanto confuso.

In questo rapporto, abbiamo adattato la nostra procedura precedente per un rendimento medio-compatibile, l'aggregazione forzata a base di tecnica per generare EBs in una dimensione altamente controllato modo, come mostrato anche in altri contesti ^13. Successivamente, l'EBS generato in forma di V pozzetti di piastre da 96 pozzetti sono state trasferite a forma di U bassissimo attaccamento piastre da 96 pozzetti, per avviare la formazione neuroectoderma in sospensione. Quattro giorni più tardi, l'EBS potrebbe essere piastrate dando origine a neuroni terminalmente differenziate ad alta efficienza e omogeneità. In alternativa, giorno-4 EBs erano dissociate in singole cellule e placcato in quanto tale, che ha portato a bassa densità monostrati di neuroni umani. Risultati coerenti sono stati finora ottenuti con due indipendentemente delinee di hESC rived, HuES6 e NCl3.

Come prerequisito, formazione EB successo era strettamente dipendente l'uso di un polimero sintetico, alcool polivinilico (PVA), insieme con inibitore ROCK Y-27.632 noto per promuovere la sopravvivenza hESC ^13-14. Come risultato, l'omogeneità del EBs formata in 96-V-piastre è stata notevolmente migliorata rispetto a formazione di EBS come culture di massa basato su metodi di frazionamento casuali. Questo sistema fornisce quindi una piattaforma significativamente migliorato per la formazione neuroectoderma in coltura in sospensione, seguito dalla formazione neurone altamente controllato in condizioni aderenti.

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Protocollo

1. Preparazione di Matrigel piastre rivestite e Media

1. Preparazione di Matrigel piastre rivestite Matrigel è stato trovato per essere un substrato preferito per il fissaggio di differenziare EBs e promuove anche la conseguenza efficiente di questi neuroni di ^10.
   1. Scongelare 10 ml di una notte sul ghiaccio Matrigel.
   2. Il giorno dopo, diluire il gelatinosa Matrigel con due volumi di ghiaccio-freddo DMEM/F-12 e preparare aliquote di 1 ml in prechilled provette da 15 ml coniche che possono essere conservati congelati a -20 ° C.
   3. Decidere su un formato di piastra per la differenziazione neuronale. Per esempio, come punto di partenza, si consiglia di effettuare un primo giro di differenziazione in un 12-pozzetti. Pre-raffreddare quattro piastre da 12 pozzetti a 4 ° C. Sciogliere un'aliquota di Matrigel congelate aggiungendo 9 ml di pre-raffreddate DMEM/F-12 seguiti pipettando su e giù fino a che tutto il prediluito Matrigel è stato scongelato e disciolto.
   4. Poi, Trasferire il contenuto in un nuovo tubo da 50 ml contenente 15 ml di DMEM/F-12 su ghiaccio (diluizione finale Matrigel: 1:75). Quindi, si aggiungono 0,5 ml di Matrigel diluito ad ogni pozzetto di pre-raffreddamento 12-pozzetti. Avvolgere le piastre con Parafilm e lasciare riposare a notte RT.
   5. Giorno successivo, trasferire piastre a 4 ° C. Piastre rivestite possono essere conservati per diverse settimane prima dell'uso.
2. Media

EB medie formazione (~ 15 ml necessario effettuare differenziazione in una piastra a 96 pozzetti - vedi Tabella 1 e schema della figura 2):
DMEM/F-12 con il 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 pM Y-27.632
1x PenStrepGln

Differenziazione media (~ 30 ml necessario effettuare differenziazione in una piastra a 96 pozzetti, seguito dalla formazione neurone in uno Matrigel rivestita 12-pozzetti, vedi Tabella 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% BSA
0,5 micron PD0325901
15 um SB431542
0,5 micron Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. EB Formazione forzata

1. Grow hPSCs sotto i vostri preferiti alimentatore senza condizioni. Usiamo MEF condizionata medie su Matrigel rivestite piastre da 6 pozzetti ^15. Tuttavia, i sistemi di coltura di altri come i media definiti fatti in casa o commerciale deve anche lavorare. Al momento di avviare un esperimento differenziazione, hPSCs dovrebbe essere sub-confluenti e attiva crescita.
2. Rimuovere meccanicamente spontaneamente colonie differenziate con una punta di pipetta sterile di plastica sotto un microscopio stereo.
3. Lavare le restanti colonie indifferenziate con PBS, e digerire di singole cellule utilizzando Accutase contenente 1X Y-27632. Pellet di cellule singole mediante centrifugazione a 200 xg per 2 minuti, risospendere in un piccolo volume di mezzo di formazione EB e determinare titolo cellulare mediante un hematocytometer.
4. Aggiungi una aliquota di celluleil restante formazione medio EB comportare un titolo tra 40.000 e 80.000 cellule per ml.
5. Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri per pozzetto di una piastra di fondo-96V, con conseguente 4000 a 8000 cellule per pozzetto. Spin piastra da 96 pozzetti in un incernierato centrifuga piastra a 400 xg per 1 minuto per raccogliere le cellule al fondo dei pozzetti, e trasferimento incubatore per colture cellulari. EBs formerà durante la notte, come mostrato in Figura 1.

3. Neuroectoderma induzione

1. Giorno successivo (giorno 0), raccogliere EBs dalla piastra 96V sotto un microscopio stereo e trasferimento in un piccolo volume in un piatto 3,5 centimetri batterica contenente 2 ml di terreno di differenziamento. Agitare delicatamente il piatto per alcuni secondi per lavare il EBS.
2. Aggiungere 100 pl di mezzo di differenziazione per pozzetto di un ultra-bassa attacco U-bottom piastra a 96 pozzetti. In uno stereomicroscopio, il trasferimento EBS in piccoli volumi dalla lavastoviglie in 96U-pozzetti (uno EB per noill). Inserire la piastra di 96U in incubatore per colture cellulare per 4 giorni per permettere la formazione neuroectoderma.

4. Neuron Formazione

1. Il giorno 4, preparare un piatto di lavaggio come al punto 3.1 e inoltre sostituire DMEM/F-12 in un pre-riscaldato Matrigel rivestita 12-pozzetti da terreno di differenziamento (1 ml per pozzetto).
2. Placcatura di EBS
   1. Raccogliere EBs dalla piastra 96U, lavare questi semi come sopra, e con cura uno per uno nei pozzetti del Matrigel rivestite 12-pozzetti (circa 8 EBs per pozzetto): EB deve essere equamente distribuita all'interno dei pozzetti per consentire di conseguenza indisturbato neuroni nel corso dei prossimi giorni (vedi immagine "ore 5" in Figura 2).
   2. Prima del trasferimento del 12 e piastra posteriore in incubatrice, EBs consentono di collegare liberamente per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Poi, trasferire accuratamente 12 pozzetti alla cultura incubatore cellulare. Neuroni crescerà fuori dal placcato EBs in modo radiale entro 4 giorni, come shown in figura 2 (il "Giorno 8" immagine a destra).

5. Formazione Neuron come monostrati

1. In alternativa alle fasi del punto 4), al giorno 4 della procedura, raccogliere EBs in un piatto 3,5 centimetri batterica contenente 2 ml di terreno di differenziamento, poi trasferire EBs in un piccolo volume di PBS contenente un piatto, e poi in un altro piatto contenente Accutase.
2. Lasciate digerire a cellule singole, centrifugare a 200 xg per 2 minuti, risospendere in un piccolo volume di terreno di differenziamento e determinare titolo cellulare mediante un hematocytometer. Regolare il titolo a 1-2X10 ⁶ cellule per ml con terreno di differenziamento (senza Y-27632).
3. Cellule piastra out in pre-riscaldato Matrigel rivestite 12-pozzetti (1 ml per pozzetto), e trasferimento in coltura cellulare incubatore. Formazione neurone come monostrati è stata osservata tra i giorni 7-8 (Figura 3C). Va notato, tuttavia, che questa variante del monostratola procedura non è completamente ottimizzato per quanto riguarda la sopravvivenza delle cellule e substrato più adatto.

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Risultati

Nella nostra precedente relazione, in linea con molti altri, EBs da hPSCs potrebbe essere generato semplicemente replating aggregati al momento scissione di routine di hPSCs in basso attaccamento piatti ^10. Questo di solito si traduce in una distribuzione gamma di formati EB risultanti (Figura 1C, in alto). Un altro problema derivante da questo è che EBs mantenute in sospensione tendono ad aggregarsi tra loro, portando ad una eterogeneità ancora maggiore di dimensioni EB. Per aggirare quest...

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Discussione

Maggior parte dei protocolli di differenziazione che comportano la formazione di EB da hPSCs, compresa la nostra procedura precedentemente pubblicato con il ^10, sono basati su manuale o enzima-assistita raccolta di hESC come aggregati, il che porta inevitabilmente a eterogeneità nei formati EB. Questo fatto porta a variabilità in efficienza differenziazione con alcune linee cellulari, rendendo così difficile analisi sistema, in particolare su scala velocità media. Inoltre, la dissezione manuale è alta in...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Vedere il testo per ulteriori dettagli sulla gestione
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poli (vinil alcool)	Sigma	363170	Sciogliere al 0,4% in DMEM/F-12 utilizzando un bagno d'acqua ad ultrasuoni / evitare il surriscaldamento / può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane
N2 Supplemento	Life Technologies	17502-048	100X, memorizzare come aliquote congelate
B27 Supplemento	Life Technologies	12587-010	50X, negozio come aliquote congelate
Albumina di siero bovino	Sigma	A1595	10% = 500X, negozio come aliquote congelate
L-Glutammina con penicillina / streptomicina	PAA	P11-013	O equivalente
FGF2	Peprotech	100-18B	Sciogliere a 10 pg / ml in 0,1% di BSA / PBS = 1000X, negozio come aliquote congelate
ROCK inibitore Y-27.632	abcamBiochemicals	Asc-129	Sciogliere a 10 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
PBS	PAA	H15-002	O equivalente
Accutase	PAA	L11-007
Da 96 pozzetti con fondo a V piastre	Nunc	277143
PD0325901	Axon medchem	Axon 1408	Sciogliere a 0.5 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	sciogliere a 15 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	sciogliere a 0.5 mM in DMSO = 1000X, negozio come aliquote congelate
96 pozzetti U-basso ultra-low di fissaggio piastre	Corning	7007
beta-III anticorpo Tubulin (mouse)	Sigma	T8660	utilizzare a 1:1000
beta-III tubulina (coniglio)	Covance	PRB-435P	utilizzare a 1:2000
BRN3A (POU4F1) anticorpo	Santa Cruz	sc-8429	utilizzare a 1:500
			Tabella 1. </ Strong> reagenti e attrezzature specifiche.