Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Özet

Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.

Özet

Insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) gelen nöronların nesil için mevcut protokoller genellikle önceden terminal farklılaşma için nöral prekürsör hücrelerinin izolasyonu ve genişleme içeren çok adımlı prosedürler vardır bunda sıkıcı vardır. Bu zaman alıcı bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında, son zamanlarda üç sinyalleme yolları, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF ve / ERK, kombine inhibisyonu fonksiyonel nöron içine hemen fark ardından hPSCs gelen nöroektodermin hızlı bir indüksiyon teşvik olduğunu bulduk. Burada, biz daha da tekrarlanabilirlik geliştirmek ve orta hacimli uygulamalar ile uyumlu hale getirmek için, bir roman multititre plaka formatı bizim prosedürü adapte etmişlerdir. Yapışık koşullar altında nöronlara geri farklılaşma bir başka dört gün ardından yüzer küreler (embriyoid gövdeler), oluşum içinde nöroektodermin dört gün kapsamaktadır. Bu protokol ile elde Hücrelerin çoğu bipolar duyusal nöronlar görünmektedir. Ayrıca,prosedürü, yüksek verimli olup özellikle uzman beceri gerektirmez, ve maliyet-etkin küçük moleküllerin basit bir kimyasal yapısı orta dayanmaktadır. Bu özellikleri sayesinde, işlem daha fazla fonksiyonel inceleme için yararlı bir platform olarak hem de hücre-bazlı tarama insan duyu nöronlarının veya herhangi bir tür nöronlar gerektiren yaklaşımlar için de kullanılabilir.

Giriş

hPSCs, oluşan embriyo kökenli insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs), onlar vitro ^1-2 çeşitli hücre soylarının ortaya çıkmasına neden olabilir pluripotent anlamı vardır. Çok sayıda farklı hücre tipleri bu hücrelerin bilimsel araştırma ve hücre tabanlı tarama yaklaşımlar için değerli araçlar sunmak, ve hücre tabanlı tedavi için ümit vaat fikrini destekleyen güncel hESC elde edilmiştir.

Genellikle ilgi ^3-6 belirli bir nöron tipi içine nöral progenitörlerinin manuel izolasyon ve sonraki terminal farklılaşma ardından ilk uyaran genel nöral kaderi esas olarak hESC için nöronal farklılaşma protokoller genellikle karmaşık ve zaman alıcıdır. Bazı bağlamda, bu karmaşıklığı erken insan gelişimi, hangi mimik gibi state-of-the-art yönettiği farklılaşma mekanizmalarının aşamalı eğilimi göz önüne alındığında şaşırtıcı ve kaçınılmaz değildirh kendi içinde son derece karmaşık. Diğer yandan, kısmen de uzak tam olarak optimize edilmesini hala farklılaşma protokolleri ile sonuçlanan, altta yatan moleküler süreçleri anlama eksikliği bizim yansıtıyor olabilir.

Nöroektodermin Pera, et al farklılaşmamış hPSCs dönüşüm ile ilgili olarak. BMP / SMAD1/5/8 sinyalizasyon bastırılması hESC ⁷ nöral indüksiyonu arttırdığını buldu. Ayrıca, Smad2 / 3 sinyal inaktivasyonu nöroektodermin oluşumunu teşvik etmek için ⁸ gösterilmiştir. Buna göre, bu iki yolun kombine inaktivasyonu hPSCs ^4,9 arasında daha verimli sinir indüksiyonuna yol açma eğilimindedir. Daha yakın zamanlarda, biz üçüncü bir sinyal yolağı, FGF / ERK, hESC içinde nöroektodermal taahhüdü ilk adımları güçlü bir baskılayıcı olarak hizmet verdiğini göstermiştir. Tersine, tüm bu üç yollarının eş zamanlı baskı ile nöroektodermin içine hESC yakın homojen dönüşüm yol¹⁰ sadece dört gün içinde. Akabinde, fonksiyonel nöronlar içine yüksek verimli terminal farklılaşma sekiz gün içinde gözlenmiştir. Elde nöronlar kısmen onların hızlı derivasyon ¹⁰ açıklayabilir periferik sinir sistemi, duyu nöronlar olması olasılığı vardı. Duyusal nöron bakım Kusur gibi ailesel disotonomi ¹¹ gibi bazı insan hastalıkları nedeni kabul edilir. Bu gibi başka fonksiyonel karakterizasyonu için hiPSC teknolojisi ¹² dayalı hastalıklar, nöron de herhangi bir özel tür istenmediğinde uygulamalı amaçlı olarak modellenmesi için, bu işlem yararlı bir türev olarak mevcut olabilir.

Ancak, farklılaşma biz aslında hESC koloniler ¹⁰ kümeleri gelen embriyonik organları dahil oluşumu (EBS) istihdam stratejisi ve bu EB boyutları ile ilgili heterojenlik oldukça derecesi sonuçlandı, ve ayrıca bazı ce nöron oluşumunu verimliliğini tehlikeye çıktıll hatları. Ayrıca, EB boyutlarda heterojenliği nedeniyle, sistematik nöron oluşumu sırasında ve sonrasında ek büyüme faktörleri veya küçük moleküllerin etkilerini test etme olanağı biraz şaşırmış göründü.

Bu yazıda, aynı zamanda diğer bağlamlarda ^13'te gösterilen, son derece boyutu-kontrollü bir şekilde EBS oluşturmak için bir orta throughput uyumlu, zorla kümeleme tabanlı tekniği bizim önceki yordamı uyarlanmıştır. Daha sonra, süspansiyon EBS olarak nöroektodermin oluşumunu başlatmak üzere, 96-oyuklu plakalar V-şekilli U şeklinde kuyuları ultra-düşük bağlanma plakaları 96-aktarılmıştır oluşturulur. Dört gün sonra, EBS yüksek verim ve homojenliği de ölümcül diferansiye nöronların doğuran üzerinden kaplanmış olabilir. Alternatif olarak, gün-4 EBS tek hücre halinde ayrılmış ve insan nöronların düşük yoğunluklu mono tabakaları ile sonuçlanan, örneğin dışarı kaplama. Koherent sonuçlar şimdiye kadar iki bağımsız de elde edilmiştirrived hESC hatları, HuES6 ve NCL3.

Bir ön koşul olarak, başarılı EB oluşum birlikte HESC hayatta kalma ^13-14 teşvik etmek için bilinen KAYA inhibitörü Y-27632 ile birlikte, bir sentetik polimer, polivinil alkol (PVA) kullanımı üzerinde sıkı bir şekilde bağlı olduğu anlaşılmıştır. Sonuç olarak, EBS homojenliği 96-V-plakaları içinde oluşan büyük ölçüde rasgele bölme tekniklerine dayalı kütle kültürler olarak EBS oluşumu göre geliştirilmiştir. Bu sistem, bu nedenle yapışkan koşullar altında yüksek kontrollü nöron oluşumu, ardından süspansiyon kültürü içinde nöroektodermin oluşumu için önemli ölçüde geliştirilmiş bir platform sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Matrigel kaplı plakalar ve Medya hazırlanması

1. Matrigel kaplı plakalar Matrigel hazırlanması EBS farklılaşan tutturulması için tercih edilen bir alt tabaka olduğu bulunmuştur ve aynı zamanda bu ¹⁰ nöronların etkili fazla büyüme teşvik edilmiştir.
   1. Buz üzerinde gecede Matrigel Çözülmeye 10 ml.
   2. Ertesi gün, buz DMEM/F-12 iki ciltlik jöle benzeri Matrigel sulandırmak ve -20 ° C'de dondurularak saklanmalıdır olabilir önceden soğutulmuş 15 ml konik tüpler içinde 1 ml alikotları hazırlamak
   3. Nöronal farklılaşma için bir tabak biçimi üzerinde karar verin. Örneğin, bir başlangıç ​​noktası olarak, bir 12-kuyu biçiminde farklılaşma ilk turda yapılmasını önermekteyiz. 4 ° C'de ön-serin dört adet 12 oyuklu plakalar Her prediluted Matrigel çözülmüş ve çözünene kadar yukarı ve aşağı pipetleme ardından önceden soğutulmuş DMEM/F-12 9 ml ilave edilerek dondurulmuş Matrigel bir kısım eritilir.
   4. O zaman, Buz (nihai Matrigel seyreltme: 1:75) üzerinde DMEM/F-12 15 ml içeren 50 ml'lik yeni bir tüp içine içeriği aktarın. Daha sonra, önceden soğutulmuş 12 oyuklu plakalar, her bir kuyucuğa Matrigel seyreltilmiş 0.5 ml eklenir. Parafilm ile plakaları sarın ve gece oda sıcaklığında bekletin.
   5. Ertesi gün, 4 ° C'ye plakaları aktarmak Kaplamalı plakalar kullanılmadan önce birkaç hafta saklanabilir.
2. Medya

EB formasyonu orta (bir 96-plaka farklılaşma gerçekleştirmek için gerekli ~ 15 ml - Şekil 2 Tablo 1 ve şemaya bakınız):
DMEM/F-12 0.4 ile% alkol (PVA)
1x N2
1x B27
% 0.05 BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln

Farklılaşma, orta (bir 96-plaka farklılaşma gerçekleştirmek için gerekli ~ 30 ml, tek Matrigel kaplı 12-plaka nöron oluşumunu takip bkz. Tablo 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
% 0.05 BSA
0.5 uM PD0325901
15 uM SB431542
0.5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Zorla EB Oluşumu

1. Tercih besleyici serbest koşullarda hPSCs büyütün. Biz Matrigel kaplı 6-kuyucuğu ¹⁵ MEF-klimalı ortamda kullanabilirsiniz. Ancak, ev yapımı ya da ticari tanımlanan medya gibi diğer kültür sistemleri de çalışması gerekir. Farklılaşma deney başlangıç ​​zamanda, hPSCs alt birleşik ve aktif büyüyen olmalıdır.
2. Mekanik bir stereo mikroskop altında steril plastik pipet kullanarak kendiliğinden ayırt koloniler çıkarın.
3. 1X Y-27632 içeren Accutase kullanarak tek hücreler PBS ve özet kullanarak kalan indiferansiye koloniler yıkayın. EB oluşum ve bir orta hematocytometer kullanarak hücre titre belirlemek küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon 2 dakika için 200 x g'de santrifüj ile pelet tek bir hücre.
4. Hücrelerin bir kısım ekleml başına 40.000 ve 80.000 hücreler arasında titre sonuçlanması kalan EB formasyonu orta.
5. Bir çok kanallı pipet kullanarak, kuyu başına 4.000 ila 8.000 hücreleri sonuçlanan bir 96V-alt plaka kuyu başına 100 ul aktarın. 1 dakika boyunca 400 xg'de bir salıncak-plakası santrifüj Spin 96-plaka kuyu dibinde hücreleri toplamak, ve hücre kültürü inkübatör aktarmak. Şekil 1 'de gösterildiği gibi EBS, bir gecede oluşturacaktır.

3. Nöroektodermin İndüksiyon

1. Ertesi gün (0. gün), farklılaşma, orta 2 ml içeren 3,5 cm bakteriyel çanak içine küçük bir hacimde bir stereo mikroskop ve transfer altında 96V plaka EBS toplamak. Yavaşça EBS yıkamak için birkaç saniye için çanak ajitasyon.
2. 100 farklılaşma orta ul başına iyi bir ultra-düşük-eki U-alt 96-plaka ekleyin. Stereomikroskopta altında, 96U-kuyulara bulaşık gelen küçük hacimli transferi EBS (biz başına bir EBll). Nöroektodermin oluşumuna izin vermek için 4 gün boyunca hücre kültürü inkübatör içine yerleştirin 96U plakası.

4. Nöron Oluşumu

1. 4. günde, adım 3.1 'deki gibi bir bulaşık hazırlamak ve ayrıca farklılaşması orta (kuyu başına 1 ml) önceden ısıtılmış Matrigel kaplı 12-plaka içinde DMEM/F-12 değiştirin.
2. EBS Kaplama
   1. 96U plaka EBS toplayın, bu yukarıdaki gibi ve dikkatle tohum yıkayın onları Matrigel kaplı 12-plaka kuyu içine bir (kuyu başına yaklaşık 8 EBS) tek: EBS eşit rahatsız edilmeden sonucudur izin kuyu içinde dağıtılmış olmalıdır önümüzdeki günlerde nöronlar (Şekil 2 "Günde 5" resme bakın).
   2. Kuvöz içine 12-plaka geri devir işleminden önce, EBS gevşek RT yaklaşık 10 dakika eklemenize izin verir. Daha sonra, hücre kültürü kuluçka makinesi ile 12-kuyucuklu levha dikkatli bir şekilde aktarılır. Nöronlar Sho olarak, bir sonraki 4 gün içinde, bir radyal bir şekilde dışarı kaplama EBS büyüyecekŞekil 2'de wn ("günlük 8" sağdaki resim).

5. Monolayers olarak Nöron Oluşumu

1. Noktası 4 adım alternatif olarak), prosedürün 4. günde, farklılaşma, orta 2 ml içeren 3,5 cm bakteriyel yemeğin içine EBS toplamak, sonra sonra içine bir PBS içeren çanak küçük bir hacimde EBS aktarabilir ve Accutase içeren başka bir yemek.
2. Farklılaşma orta küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon tek hücreler, 2 dakika için 200 x g'da santrifüj, ile sindirmek ve bir hematocytometer kullanarak hücre titre belirlesin. Farklılaşma, orta (Y-27632 olmadan) kullanarak ml başına 1-2x10 ⁶ hücre için titre ayarlayın.
3. Önceden ısıtılmış Matrigel kaplı 12 oyuklu plaka (çukur başına 1 mi) çözündürüldü, ve hücre kültürü kuluçka makinesi için transfer Levha hücreleri. Mono tabakalar olarak Neuron oluşum günde 7-8 (Şekil 3C) arasında gözlenmiştir. Bununla birlikte, belirtilmelidir ki, bu tek tabaka varyantprosedürün tam hücre sağkalım ve en uygun substrat açısından optimize edilmemiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir önceki raporda, pek çok diğerleri ile uyumlu, hPSCs gelen EBS düşük eki yemekler ¹⁰ içine hPSCs rutin bölüştürülmesi sırasında agrega replating basitçe oluşturulmuş olabilir. Çıkan EB boyutları (Şekil 1C, üst) geniş bir dağılım Bu genellikle sonuçları. Bu kaynaklanan bir başka sorun süspansiyon muhafaza EBS EB boyutlarda da yüksek heterojenite giden, birbirleri ile agrega eğiliminde olmasıdır. Bu sorunları aşmak için, biz bu nedenle multititre plakalar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bizim önceden yayınlanmış prosedürü dahil olmak üzere ¹⁰ hPSCs, gelen EB oluşumunu gerektirmeyen En farklılaşma protokolleri manuel veya kaçınılmaz EB boyutlarda heterojenite neden agrega gibi hESC enzim destekli hasat dayanmaktadır. Bu durum, bu şekilde üretilen bir orta boyutta, özellikle de sistematik analiz zor hale getirir bazı hücre çizgilerinden ile farklılaşması verim olarak değişkenlik yol açar. Ayrıca, manuel diseksiyon kendisi tarafından ölçeklenebilirlik ödün hangi ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Kullanımı ile ilgili ayrıntılar için metne bakınız
DMEM/F-12	Yaşam Teknolojileri	21331-020
Poli (vinil alkol)	Sigma	363170	Ultrasonik su banyosunda kullanılarak DMEM/F-12 yılında% 0.4 Erime / aşırı ısınmasını önlemek / 4 ° C'de birkaç hafta boyunca muhafaza edilebilir
N2 Supplement	Yaşam Teknolojileri	17502-048	100X, dondurulmuş alikotları olarak depolamak
B27 Supplement	Yaşam Teknolojileri	12587-010	Dondurulmuş alikotları olarak 50X, mağaza
Bovine Albumin Serum	Sigma	A1595	% 10 = 500X, dondurulmuş alikotları olarak depoladığınız
Penisilin / Streptomisin L-Glutamine	PAA	P11-013	Veya eşdeğeri
FGF2	Peprotech	100-18B	Dondurulmuş alikotları olarak% 0,1 10 mg / ml 'de çözülür BSA / PBS = 1000X, mağaza
KAYA inhibitörü Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 10 mM eritilir
PBS	PAA	H15-002	Veya eşdeğeri
Accutase	PAA	L11-007
96-V-alt plakalar	Nunc	277143
PD0325901	Akson Medchem	Akson 1408	Dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 0.5 mM eritilir
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 15 mM çözülür
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dondurulmuş alikotları olarak DMSO = 1000X, mağaza 0.5 mM çözülür
96-U-bottom ultra-düşük eki plakaları	Corning	7007
beta III tubulin antikoru (fare)	Sigma	T8660	1:1000 'yi kullanabilirsiniz
beta III tubulin antikoru (tavşan)	Covance	SORUN-435P	1:2000 'yi kullanabilirsiniz
BRN3A (POU4F1) antikoru	Santa Cruz	sc-8429	1:500 de kullanabilirsiniz
			Tablo 1. </ Strong> Özel reaktifleri ve ekipmanlar.