Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

요약

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

초록

인간 만능의 줄기 세포 (hPSCs)에서 뉴런의 생성을위한 기존 프로토콜은 종종 이전에 터미널 차별화에 신경 전구체 세포의 분리 및 확장을 포함하는 다단계 절차되기 때문에 지루한 수 있습니다. 이 시간이 많이 소요되는 방식에 비해, 우리는 최근 세 신호 경로, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, 그리고 FGF / ERK의 결합 억제가 작동 뉴런에 즉시 차별화 다음 hPSCs에서 neuroectoderm의 빠른 유도를 촉진하는 것으로 확인되었습니다. 여기, 우리는 더 이상 그 재현성을 향상하고 중간 처리 응용 프로그램과 호환하기 위해, 소설 multititre 판 형식으로 절차를 조정했습니다. 이 자기편 조건에서 뉴런으로 차별화의 다른 사일에 이어 부동 영역 (embryoid 기관)에 neuroectoderm 형성 4 일을 포함한다. 이 프로토콜을 획득 대부분의 세포는 양극성 감각 뉴런 것 같습니다. 또한,절차는 매우 효율적이다 특히 전문적인 기술을 필요로하지 않으며, 비용 효율적인 작은 분자로 간단한 화학적으로 정의 된 매체에 기반을두고 있습니다. 이러한 기능으로 인해, 절차는 더 기능적 조사를위한 유용한 플랫폼으로뿐만 아니라 세포 기반 스크리닝 인간의 감각 뉴런 또는 유형의 뉴런을 요구하는 접근에 사용될 수 있습니다.

서문

hPSCs는, 상기 배아를 파생 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)을, 그들은 체외 ^1-2에 다양한 세포 lineages을 야기 할 수있는 만능 의미합니다. 수많은 차별화 된 세포 유형은 이러한 세포 연구 및 세포 기반 스크리닝 방법에 대한 유용한 도구를 제시하고, 셀 기반의 치료학에 대한 약속을 보유하는 개념을 지원하는 최신 hESCs에서 파생되었습니다.

그들은 종종 관심을 ^3-6 주어진 신경 세포 종류에 신경 progenitors의 수동 고립, 그리고 이후의 터미널 차별화에 이어 첫번째 유도 전반적인 신경 운명에 기초로 hESCs에 대한 Neuronal 차별화 프로토콜은 일반적으로 복잡하고 시간이 많이 소요됩니다. 어떤 점에서,이 복잡성은 초기 인간 발달, whic을 모방 등 최첨단의 지시 차별화 프로토콜은 stepwise 경향이 있다는 것을 감안하면 놀라운과 피할 수 없습니다H는 그 자체로 매우 복잡합니다. 한편,이 부분도 지금까지 완전히 최적화되지 여전히 차별화 프로토콜의 결과로, 기본 분자 프로세스에 대한 이해의 부족이 반영 될 수 있습니다.

neuroectoderm, 페라 외에 undifferentiated hPSCs의 전환에 관해서이 있습니다. BMP / SMAD1/5/8 신호의 억제는 hESCs ⁷ 신경 유도를 향상 것으로 나타났습니다. 또한, SMAD2 / 3 신호의 불 활성화는 neuroectoderm 형성 ^팔을 홍보하기 위해 표시되었습니다. 따라서,이 두 경로의 결합 불 활성화는 hPSCs ^4,9을보다 효율적으로 신경 유도로 연결하는 경향이있다. 최근, 우리는이 세 신호 경로는 FGF / ERK는 hESCs의 neuroectodermal의 노력의 초기 단계 강력한 억제 역할을하는 것으로 나타났습니다. 반대로, 모든이 세 경로의 동시 억압이와 neuroectoderm로 hESCs의 거의 균일 전환 될¹⁰ 단 사일 인치 그 후, 기능 뉴런에 고효율 터미널 차별화은 8 일 이내에 관찰되었다. 획득 뉴런이 부분에서 자신의 빠른 파생 ^열을 설명 할 수 있습니다 주변 신경계의 감각 뉴런 될 가능성이 있었다. 감각 신경 세포의 유지 보수에 결함이 이러한 가족 dysautonomia ^11와 같은 특정 인간의 장애의 원인을 받고 있습니다. 이러한 추가 기능 특성에 대한 hiPSC 기술을 ^{12 일} 기준으로 질환,뿐만 아니라 뉴런의 특정 유형을 필요로하지 적용 목적으로 모델링를 들어,이 차별화 절차 유용한 근거를 제시 할 수 있습니다.

그러나, 차별화를 우리가 원래 hESC의 식민지 ¹⁰ clumps에서 배아 기관의 참여 형성 (EBS)를 고용 전략, 그리고이 EB 크기에 대한 이질성의 꽤 정도의 결과, 또한 일부 CE에 신경 형성의 효율성을 손상 등장붙인다 라인. 또한, EB 크기의 이질성으로 인해 체계적으로 신경 세포 형성 과정과 이후로 추가 성장 요인 또는 작은 분자의 효과를 테스트 할 수있는 능력이 다소 실마리를 못 찾고 할 것처럼 보였다.

이 보고서에서, 우리는 또한 다른 상황 ^13과 같이 매우 크기 제어 방식으로 EBS를 생성하는 중간 처리량 호환, 강제 집합 기반 기술에 우리의 이전 절차를 적응. 그 후, EBS는 정지 neuroectoderm 형성을 시작하려면, 96 - 웰 플레이트의 V 자형 우물 U 자형 초저 첨부 파일 플레이트 96도로 전송 된에서 생성. 나흘 후, EBS는 높은 효율성과 동질성의 말기 차별화 된 뉴런에 상승을주는 아웃 도금 될 수 있습니다. 또한, 하루 4 EBS는 단일 셀에 dissociated 있었고, 인간의 뉴런의 저밀도 monolayers 결과하는 등의 아웃 도금. 일관된 결과는 지금까지이 독립적으로 드와 함께 얻었다rived hESC 라인, HuES6 및 NCL3.

전제 조건으로 성공적으로 EB 형성 함께 hESC의 생존 ^13-14을 촉진하는 것으로 알려져 ROCK 억제제 Y-27632과 합성 폴리머, 폴리 비닐 알코올 (PVA)의 사용에 엄격히 의존했다. 그 결과, EBS의 동질성은 96 V-플레이트 년에 설립이 실질적으로 무작위로 분할 기법에 따라 대량 문화 등 EBS의 형성에 비해 향상되었습니다. 이 시스템은 따라서 점착성의 조건 하에서 철저히 통제되고 신경 세포 형성에 이어 서스펜션 문화에 neuroectoderm 형성을위한 대폭 개선 된 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

1. Matrigel 코팅 플레이트와 미디어의 작성

1. Matrigel - 코팅 접시에 Matrigel의 준비는 EBS를 차별화의 첨부 파일 선호하는 기판이 발견 있으며,이 ^{10 일부터} 뉴런의 효율적인 가지를 촉진하고 있습니다.
   1. 얼음에 박 Matrigel의 해동 10 ML.
   2. 다음 날, 얼음처럼 차가운 DMEM/F-12의 두 권으로 젤리 같은 Matrigel을 희석하여 -20 ° C.에서 냉동 저장 될 수 있습니다 prechilled 15 ML 원뿔 튜브에 1 ML의 aliquots을 준비
   3. neuronal 차별화 판 형식에 따라 결정합니다. 예를 들어, 시작 지점으로, 우리는 12도 형식의 차별화의 초기 원형을 수행하는 것이 좋습니다. 4 ° C.에서 사전 시원한 사 12 잘 접시 모든 prediluted Matrigel는 해동하고 해산 될 때까지 위아래로 pipetting 다음 사전 차가운 DMEM/F-12 9 ML을 추가하여 냉동 Matrigel 중 하나 나누어지는을 분해.
   4. 그때, 얼음 (최종 Matrigel 희석 : 1:75)에 DMEM/F-12 15 ML를 포함하는 새로운 50 ML 튜브에 내용을 전송합니다. 그런 다음 미리 냉각 12도 플레이트의 각도에 희석 Matrigel의 0.5 ML를 추가합니다. Parafilm으로 접시를 정리하고 하루 아침에 RT에 서 보자.
   5. 다음 날, 4 ° C.에 접시를 전송 코팅 플레이트는 사용하기 전에 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다.
2. 미디어

EB 형성 매체 (한 96 - 웰 플레이트에 차별화를 수행하기 위해 필요한 ~ 15 ML - 그림 2의 표 1과 계획을 참조하십시오) :
DMEM/F-12 0.4과 % (PVA)
1X N2
1X B27
0.05 % BSA
20 NG / ML FGF2
10 μM Y-27632
1X PenStrepGln

차별화 매체 (한 96 - 웰 플레이트에 차별화를 수행하기 위해 필요한 ~ 30 ML, 그 중 하나 Matrigel 코팅 12 잘 플레이트에 신경 형성 한 다음, 표 1 참조) :
DMEM/F-12
1X N2
1X B27
0.05 % BSA
0.5 μM PD0325901
15 μM의 SB431542
0.5 μM의 Dorsomorphin
1X PenStrepGln

2. 강제 EB 형성

1. 선호하는 피더 - 무료 조건 하에서 hPSCs 성장. 우리는 Matrigel 코팅 6 잘 플레이트 ^{15 일} MEF이 설치된 매체를 사용합니다. 그러나, 수제 또는 상업적 정의 미디어 등 다른 문화 시스템은 작동합니다. 차별화의 실험을 시작하는 때, hPSCs 하위 합류 적극적으로 성장해야합니다.
2. 기계적 스테레오 현미경으로 멸균 플라스틱 피펫 팁을 사용하여 자발적으로 차별화 된 식민지를 제거합니다.
3. 1X Y-27632을 포함 Accutase를 사용하여 하나의 셀에 PBS 및 알림을 사용하여 남아있는 undifferentiated 식민지을 씻는다. EB 형성 매체와 hematocytometer를 사용하여 셀 titre을 결정의 작은 볼륨에 resuspend 2 분, 200 XG에서 원심 분리하여 펠렛 단일 세포.
4. 에 세포의 나누어지는을 추가ML 당 40,000 달러 그리고 80,000 세포 사이의 titre 될 수있는 나머지 EB 형성 매체입니다.
5. 멀티 채널 피펫 사용하여 잘 당 4,000 8,000 셀의 결과, 96V 아래로 판에 잘 당 100 μl를 전송합니다. 1 분 400 XG에서 스윙 아웃 플레이트 원심 분리기의 회전 96 - 웰 플레이트는 우물의 맨 아래에있는 세포를 수집하고, 세포 문화 인큐베이터로 전송합니다. 그림 1에 표시된 것과 같이 EBS는 하루 아침에 형성됩니다.

3. Neuroectoderm 유도

1. 다음 날 (일 0), 차별화 매체 2 ML을 포함하는 3.5 cm 세균 요리로 작은 볼륨에서 스테레오 현미경 및 전송에서 96V 접시에서 EBS를 수집합니다. 부드럽게 EBS를 씻어하는 데 몇 초 정도의 요리를 선동.
2. 100 차별화 매체의 μl 당 잘 울트라 - 로우-첨부 U-하단 96 - 웰 플레이트를 추가합니다. stereomicroscope 아래 96U-우물로 세척 접시에서 작은 볼륨으로 전송 EBS (우리 당 하나의 EB붙인다). neuroectoderm 형성을 허용하는 4 일간 세포 배양 배양기에 장소 96U 판.

4. 신경 세포 형성

1. 일 4 일 단계 3.1에서와 같이 세척 접시를 준비하고 추가로 차별화 매체 (물론 당 1 ML)에 의한 사전 예열 Matrigel 코팅 12 잘 판에 DMEM/F-12를 교체하십시오.
2. EBS의 도금
   1. 96U 판에서 EBS를 수집,이 위, 그리고 조심스럽게 씨앗에게 씻어 그 Matrigel 코팅 12 잘 접시의 우물에 하나 (물론 당 약 8 EBS)의 하나 EBS는 동등의 방해받지 가지를 허용하도록 우물에서 배포되어야한다 다음 일 동안 뉴런 (그림 2의 "일 5"이미지 참조).
   2. 보육에 12 잘 판을 다시 양도하기 전에, EBS는 느슨하게 RT에서 약 10 분에 연결 할 수 있습니다. 그런 다음, 세포 배양 배양기에 12 잘 판을주의 깊게 전송합니다. 뉴런은 우로서 다음 4 일 이내에 방사형 방식으로 도금 EBS에서 알아 성장그림 2에서 wn ( "일 8"오른쪽 이미지).

5. Monolayers 등의 신경 조직

1. 포인트 4 단계의 대안으로), 절차의 4 일에서 차별화 매체 2 ML을 포함하는 3.5 cm 세균 그릇에 EBS를 수집 한 다음에 다음 PBS 함유 음식에 작은 볼륨으로 EBS를 전송하고, Accutase를 포함하는 다른 음식.
2. 차별화 매체의 작은 볼륨에 resuspend 하나의 세포, 2 분 200 XG에서 원심 분리기로 소화하고 hematocytometer를 사용하여 셀 titre를 결정하자. 차별화 매체를 (Y-27632이없는)를 사용하여 ML 당 1 2X10 ⁶ 셀에 titre를 조정합니다.
3. 사전 예열 Matrigel 코팅 12 잘 플레이트 (물론 당 1 ML) 및 세포 문화 인큐베이터로 전송에 판 세포 아웃. monolayers으로 신경 세포 형성은 일 7-8 (그림 3C) 사이에 관찰되었다. 그것은 그러나, 주목해야합니다 그의 monolayer 변종절차는 완전히 세포 생존과 가장 적합한 기판에 적용되는 최적화되어 있지 않습니다.

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결과

이전 보고서에서, 많은 다른 사람들과 라인에, hPSCs에서 EBS가 낮은 첨부 요리 ^{(10) 내로} hPSCs의 일상 분할시 응집체를 replating으로 간단하게 생성 할 수 있습니다. 결과 EB 크기 (그림 1C, 상단)의 다양한 배포판이 일반적으로 발생합니다. 이로 인해 또 다른 문제는 정지 유지 EBS는 EB 크기의 더 높은 이질성로 이어지는, 서로 통합 경향이 있다는 것입니다. 이러한 문제를 회피하기 ?...

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토론

우리 이전에 다음 ID로 출판 절차 ^10을 포함 hPSCs,에서 EB 형성을 포함한 대부분의 차별화 프로토콜은 수동 또는 필연적 EB 크기로 이질성로 연결 집계 등 hESCs의 효소를 이용한 수확을 기반으로합니다. 이 사실은이를 중간 처리량 규모에서, 특히 체계적인 분석이 어려운 렌더링, 일부 세포 라인 차별화 효율의 변화로 연결됩니다. 또한, 수동 해부 자체가 확장 성을 떨어 뜨리고있는 노동 집약...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
Matrigel HC	Becton 디킨슨	354263	처리에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오
DMEM/F-12	생명 기술	21331-020
폴리 (비닐 알코올)	시그마	363170	초음파 waterbath를 사용하여 DMEM/F-12에 0.4 %에서 분해 / 과열 방지 / 4에서 ° C 몇 주 동안 계속 될 수있다
N2의 보충	생명 기술	17502-048	100X, 냉동 aliquots로 저장
B27 보충	생명 기술	12587-010	냉동 aliquots로 50X, 저장
소 혈청 알부민	시그마	A1595	10% = 500X, 냉동 aliquots로 저장
페니실린 / 스트렙토 마이신과 L-글루타민	PAA	P11-013	또는 동급
FGF2	Peprotech	100-18B	냉동 aliquots로 0.1 %에서 10 μg / ML에서 분해 BSA / PBS = 1000X, 저장
ROCK 저해제 Y-27632	abcamBiochemicals	ASC-129	냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 저장의 10 MM에 디졸브
PBS	PAA	H15-002	또는 동급
Accutase	PAA	L11-007
96 - 웰 V-바닥 판	Nunc	277143
PD0325901	축삭 Medchem	축삭 1408	냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 저장에 0.5 밀리미터에 디졸브
SB431542	abcamBiochemicals	ASC-163	냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 상점에서 15 MM에 용해
Dorsomorphin	산타 크루즈 (Santa Cruz)	SC-200689	냉동 aliquots로 DMSO = 1000X, 저장에 0.5 밀리미터에 용해
96 - 웰 U-하단의 초저 첨부 파일 플레이트	코닝	7007
베타-III의 Tubulin 항체 (마우스)	시그마	T8660	1:1000에서 사용
베타-III의 Tubulin 항체 (토끼)	Covance	PRB-435P	1:2000에서 사용
BRN3A (POU4F1) 항체	산타 크루즈 (Santa Cruz)	SC-8429	1:500에서 사용
			표 1. </ strong>을 특정 시약 및 장비.