Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Résumé

Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d'importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d'un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d'une manière contrôlée.

Résumé

Protocoles existants pour la génération de neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont souvent fastidieux en ce que ce sont des procédures en plusieurs étapes impliquant l'isolement et l'expansion de cellules précurseurs neurales, avant la différenciation terminale. Par rapport à ces approches consommatrices de temps, nous avons récemment découvert que l'inhibition combinée de trois voies de signalisation, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 et FGF / ERK, favorise l'induction rapide de neuroectoderme de hPSCs, suivie par la différenciation en neurones fonctionnels immédiate. Ici, nous avons adapté notre méthode à un format multititre nouvelle plaque, afin de renforcer sa reproductibilité et de la rendre compatible avec la mi-débit des applications. Il comprend quatre jours de formation neuroectoderme dans les sphères flottantes (corps embryoïdes), suivis par quatre autres jours de différenciation en neurones dans des conditions d'adhérence. La plupart des cellules obtenues avec ce protocole semble être neurones sensoriels bipolaires. En outre,la procédure est très efficace, ne nécessite pas de compétences particulières experts, et est basé sur un simple support chimiquement défini avec rapport coût-efficacité des petites molécules. Grâce à ces caractéristiques, la procédure peut servir de plate-forme utile pour exploration fonctionnelle continue ainsi que pour le criblage cellulaire s'approche nécessitant des neurones sensoriels de l'homme ou des neurones de n'importe quel type.

Introduction

hPSCs, comprenant l'embryon issu cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs), sont pluripotentes sens qu'ils peuvent donner lieu à diverses lignées cellulaires in vitro ^1-2. De nombreux types de cellules différenciées ont été dérivées de CSEh à ce jour, en soutenant l'idée que ces cellules présentent des outils précieux pour la recherche scientifique et des approches de dépistage basés sur les cellules, et sont prometteuses pour des traitements à base de cellules.

Protocoles de différenciation neuronale des CSEh sont généralement complexes et de longue haleine car ils sont souvent basées sur l'ensemble induisant sort premier de neurones, suivie de l'isolement manuel des progéniteurs neuronaux, et la différenciation terminale ultérieure dans un type de neurone d'intérêt donné ^3-6. À certains égards, cette complexité n'est pas surprenant et inévitable, étant donné qu'un tel état-of-the-art des protocoles de différenciation dirigés ont tendance à imiter les étapes de développement du jeune homme, which est en soi extrêmement complexe. D'un autre côté, il peut aussi en partie le reflet de notre manque de compréhension des processus moléculaires sous-jacents, résultant dans des protocoles de différenciation qui sont encore loin d'être pleinement optimisée.

En ce qui concerne la conversion de hPSCs indifférenciées en neuroectoderme, Pera et al. constaté que la suppression de BMP / SMAD1/5/8 signalisation améliore l'induction neurale de hESC ^7. De plus, l'inactivation de SMAD2 / 3 de signalisation a été montré pour favoriser ⁸ Formation neuroectoderme. Par conséquent, l'inactivation combinée de ces deux voies a tendance à conduire à l'induction neurale plus efficace des hPSCs ^4,9. Plus récemment, nous avons montré que la voie de signalisation troisième FGF / ERK, sert de répresseur forte des premières étapes de l'engagement neuroectodermique dans les CSEh. En revanche, la répression simultanée de ces trois voies mènent à la quasi-homogène de conversion des CSEh dans neuroectoderme avecen seulement quatre jours ^10. Par la suite, la différenciation terminale très efficace en neurones fonctionnels a été observée dans les huit jours. Les neurones obtenus sont susceptibles d'être neurones sensoriels du système nerveux périphérique, ce qui peut en partie expliquer leur calcul rapide ^10. Les défauts de l'entretien neurone sensoriel est considéré une des causes de certaines maladies humaines telles que la dysautonomie familiale ^11. Pour modéliser ces maladies sur la base de la technologie hiPSC ^12, pour la caractérisation fonctionnelle supplémentaire, ainsi que des fins appliquées ne nécessitant pas un type particulier de neurones, cette procédure différenciation peut présenter une base utile.

Cependant, la stratégie de différenciation nous avions utilisé la formation impliqués des corps embryonnaires (EB) à partir de touffes de ¹⁰ colonies de CSEh, et ​​cela s'est traduit par un bon degré d'hétérogénéité concernant la taille des EB, et semblait aussi compromettre l'efficacité de formation des neurones dans certaines CElignes ll. En outre, en raison de l'hétérogénéité des tailles EB, la capacité de tester systématiquement les effets des facteurs de croissance ou de petites molécules pendant et après la formation des neurones semblent être quelque peu confus.

Dans ce rapport, nous avons adapté notre procédure précédente pour un support débit compatible, forcé d'agrégation basée technique pour générer EB dans un environnement hautement taille manière contrôlée, comme le montre également dans d'autres contextes ^13. Par la suite, l'EB généré en forme de V des puits de plaques 96 puits ont été transférés à U ultra-faible attachement plaques à 96 puits, pour initier la formation neuroectoderme en suspension. Quatre jours plus tard, l'EB pourraient être étalées donnant naissance à des neurones définitivement différenciées à haute efficacité et l'homogénéité. Sinon, le jour EB-4 ont été dissociées en cellules individuelles et étalées en tant que telle, qui a abouti à faible densité monocouches de neurones humains. Des résultats cohérents ont été obtenus jusqu'à présent avec deux indépendamment delignées de CSEh rived, HuES6 et NCl3.

Comme condition préalable, la formation EB succès était strictement dépendante de l'utilisation d'un polymère synthétique, l'alcool polyvinylique (PVA), avec inhibiteur de ROCK Y-27632 connue pour favoriser la survie de ^13-14 CSEh. En conséquence, l'homogénéité de l'EB formé en 96-V-plaques a été considérablement améliorée par rapport à la formation d'EB en tant que cultures de masse basés sur des techniques de fractionnement aléatoires. Ce système offre ainsi une plate-forme nettement améliorée pour la formation neuroectoderme en culture en suspension, suivie de la formation des neurones hautement contrôlé dans des conditions d'adhérence.

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Protocole

1. Préparation de Matrigel recouvertes de plaques et médias

1. Préparation de Matrigel enduit de Matrigel plaques a été trouvé pour être un substrat préféré pour la fixation de la différenciation EB et favorise également l'excroissance efficace des neurones à partir de celles-ci ^10.
   1. Décongeler 10 ml de nuit sur la glace Matrigel.
   2. Le lendemain, diluer le Matrigel comme de la gelée avec deux volumes de glace-froid DMEM/F-12 et préparer des aliquotes de 1 ml à 15 ml prérefroidi tubes coniques qui peuvent être congelés à -20 ° C.
   3. Décider sur un format de plaque pour la différenciation neuronale. Par exemple, comme point de départ, nous vous recommandons d'effectuer une première série de différenciation dans un format de 12 puits. Pré-cool quatre plaques de 12 puits à 4 ° C. Dissoudre une aliquote de Matrigel congelés en ajoutant 9 ml de pré-réfrigérés DMEM/F-12 suivis par pipetage de haut en bas jusqu'à ce que tout le Matrigel prédilué a dégelé et dissous.
   4. Puis, Transférer le contenu dans un nouveau tube de 50 ml contenant 15 ml de DMEM/F-12 sur la glace (dilution finale Matrigel: 1:75). Ensuite, ajoutez 0,5 ml de Matrigel dilué dans chaque puits de la pré-refroidis plaques de 12 puits. Envelopper les plaques avec du Parafilm et laisser reposer une nuit à TA.
   5. Le lendemain, le transfert des plaques à 4 ° C. Plaques revêtues peuvent être stockés pendant plusieurs semaines avant de l'utiliser.
2. Médias

Moyennes formation EB (~ 15 ml nécessaire pour effectuer une différenciation dans une plaque de 96 puits - voir le tableau 1 et le schéma de la figure 2):
DMEM/F-12 avec 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
20 ng / ml de FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln

Milieu de différenciation (~ 30 ml nécessaire pour effectuer une différenciation dans une plaque de 96 puits, suivie de la formation des neurones dans un enduit de Matrigel de 12 puits de plaque, voir le tableau 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
0,5 uM PD0325901
15 SB431542 uM
0,5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Formation EB forcé

1. Cultivez hPSCs sous vos préférés alimentation sans conditions. Nous utilisons MEF milieu conditionné sur Matrigel recouvertes de plaques de 6 puits ^15. Cependant, d'autres systèmes de culture tels que maison ou commerciale milieux définis devrait aussi fonctionner. Au moment de commencer un essai de différenciation, hPSCs doit être sous-confluentes et en pleine croissance.
2. Eliminer mécaniquement spontanément colonies différenciées à l'aide d'une pipette stérile en plastique sous un microscope stéréo.
3. Laver autres colonies indifférenciées en utilisant du PBS, et digérer à des cellules uniques en utilisant Accutase contenant 1X Y-27632. Sédimenter les cellules individuelles par centrifugation à 200 xg pendant 2 min, remettre en suspension dans un petit volume de milieu de formation EB et déterminer titre cellule en utilisant une hématocytomètre.
4. Ajouter une fraction aliquote de cellules dele moyen EB restante formation d'aboutir à un titre compris entre 40.000 et 80.000 cellules par ml.
5. En utilisant une pipette multicanaux, transférer 100 ul par puits dans une plaque 96V-bas, entraînant 4000 à 8000 cellules par puits. De spin 96-puits dans une centrifugeuse plaque plaque pivotant à 400 g pendant 1 min à prélever des cellules au fond du puits, et transférer à incubateur de culture cellulaire. EBS former une nuit, comme représenté sur la figure 1.

3. Induction neuroectoderme

1. Le lendemain (jour 0), la collecte de la plaque EB 96V sous un microscope stéréo et le transfert dans un petit volume dans un plat 3,5 cm bactérienne contenant 2 ml de milieu de différenciation. Agiter doucement le plat pendant quelques secondes pour laver l'EBS.
2. Ajouter 100 ul de milieu de différenciation par puits d'un ultra-faible attachement U-96 puits à fond plat. Sous un stéréomicroscope, le transfert EB dans de petits volumes de la vaisselle dans le 96U-puits (un EB par nousll). Placez la plaque 96U en incubateur de culture cellulaire pendant 4 jours afin de permettre la formation neuroectoderme.

4. Formation neurone

1. Au jour 4, préparer un plat à laver comme à l'étape 3.1 et plus remplacer DMEM/F-12 dans un préchauffé Matrigel revêtu de plaque de 12 puits par un milieu de différenciation (1 ml par puits).
2. Placage de EB
   1. Recueillir EB de la plaque 96U, lavez-les de graines comme ci-dessus, et soigneusement un par un dans les puits de la Matrigel enduit la plaque de 12 puits (environ 8 EB par puits): EB doit être également répartie dans les puits pour permettre excroissance non perturbé de neurones au cours des prochains jours (voir "jour 5" image de la figure 2).
   2. Avant le transfert de la plaque arrière de 12 puits dans l'incubateur, permettent EB à fixer sans serrer pour environ 10 min à température ambiante. Ensuite, transférez à 12 puits de plaque de culture cellulaire incubateur. Les neurones se développent à partir de l'EB plaqué de manière radiale dans les 4 prochains jours, comme shosentée en figure 2 («jour 8" image de droite).

5. Formation neurone comme monocouches

1. Comme une alternative à la procédure du point 4), au jour 4 de la procédure, de recueillir EBS dans un plat 3,5 cm bactérienne contenant 2 ml de milieu de différenciation, puis de transférer EB dans un petit volume d'un plat contenant du PBS, puis dans un autre plat contenant Accutase.
2. Laissez digérer à des cellules uniques, centrifuger à 200 xg pendant 2 min, remettre en suspension dans un petit volume de milieu de différenciation et de déterminer titre cellule en utilisant une hématocytomètre. Réglez titre de 1-2x10 ⁶ cellules par ml en utilisant un milieu de différenciation (sans Y-27632).
3. Cellules de la plaque out en préchauffé Matrigel enduit de 12 puits plaque (1 ml par puits), et le transfert de culture cellulaire incubateur. Formation neurone sous forme de monocouches a été observée entre les jours 7 à 8 (figure 3C). Il convient de noter, toutefois, que cette variante monocouche dela procédure n'est pas optimisée en ce qui concerne la survie des cellules et le substrat le plus approprié.

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Résultats

Dans notre précédent rapport, en ligne avec beaucoup d'autres, EB à partir hPSCs pourrait être généré simplement en réensemencement des agrégats sur le fractionnement systématique de hPSCs en bas de fixation plats ^10. Cela se traduit généralement par une large distribution de tailles EB résultant (figure 1C, en haut). Un autre problème résultant de cela est que EB maintenues en suspension ont tendance à s'agréger les unes aux autres, ce qui conduit à une hétérogén...

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Discussion

La plupart des protocoles de différenciation impliquant la formation EB à partir hPSCs, y compris notre procédure déjà publié ^10, sont basées sur manuel ou assisté par une enzyme de récolte des CSEh sous forme d'agrégats, ce qui conduit inévitablement à l'hétérogénéité des tailles EB. Ce fait conduit à la variabilité de l'efficacité différentiation avec certaines lignées cellulaires, ce qui rend difficile l'analyse systématique, en particulier à l'échelle de débit...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Voir le texte pour plus de détails sur la manipulation
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poly (alcool vinylique)	Sigma	363170	Dissoudre à 0,4% en utilisant un bain-marie DMEM/F-12 ultrasons / éviter la surchauffe / peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs semaines
Supplément N2	Life Technologies	17502-048	100X, stocker sous forme d'aliquotes congelés
B27 Supplément	Life Technologies	12587-010	50X, magasin comme aliquotes congelées
Sérum Albumine Bovine	Sigma	A1595	10% = 500X, magasin comme aliquotes congelées
L-Glutamine avec Pénicilline / Streptomycine	AAP	P11-013	Ou équivalent
FGF2	Peprotech	100-18B	Dissoudre à 10 pg / ml dans 0,1% BSA / PBS = 1000X, magasin comme aliquotes congelées
ROCK inhibiteur Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Dissoudre à 10 mM dans le DMSO = 1000X, magasin comme aliquotes congelées
PBS	AAP	H15-002	Ou équivalent
Accutase	AAP	L11-007
96-V et des plaques à fond	Nunc	277143
PD0325901	Axon MEDCHEM	Axon 1408	Dissoudre à 0,5 mM dans le DMSO = 1000X, magasin comme aliquotes congelées
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	dissoudre à 15 mM dans le DMSO = 1000X, magasin comme aliquotes congelées
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	dissoudre à 0,5 mM dans du DMSO = 1000X, magasin sous forme d'aliquotes congelés
De 96 puits à fond en U plaques de fixation ultra-faibles	Corning	7007
anticorps tubuline bêta-III (souris)	Sigma	T8660	utiliser moins 1:1000
anticorps tubuline bêta-III (lapin)	Covance	PRB-435P	utiliser à 1:2000
BRN3A (POU4F1) anticorps	Santa Cruz	sc-8429	utiliser à 1:500
			Tableau 1. </ Strong> réactifs et équipements spécifiques.