والحشرات<em&gt; جاليريا mellonella</em&gt; نموذجا عدوى قوية المعنية بالتحقيق في إمراض البكتيرية

Summary

haemocolic العدوى عن طريق الفم وداخل يرقات العث من الشمع أكبر جاليريا mellonella. ويمكن استخدام هذه الحشرة لدراسة العوامل الممرضة للحشرات من الفوعة وكذلك البكتيريا الانتهازية الثدييات. تربية الحشرات، وطرق العدوى والأمثلة على في الجسم الحي التحليل.

Abstract

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system¹. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides^2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals¹. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.

Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis^4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model^8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.

G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 °C to 30 °C) and infection studies can be conducted between 15 °C to above 37 °C^12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD₅₀¹⁴, measurement of bacterial survival^15,16 and examination of the infection process¹⁷. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections^18,19.

Protocol

1. تربية الحشرات

دورة كاملة من البيض إلى يرقات الطور مشاركة يستمر حوالي 5 أسابيع في C. ° 25 وهناك حاجة إلى واحد أو 2 أسابيع إضافية للحصول على الفراشات الكبار.

1. وضع لا يقل عن 100 الشرانق أو دمجها حديثا G. الكبار الفراشات في قفص mellonella شبكات الأسلاك المعدنية 5-لتر. الفراشات الذكور قياس 10 حتي 15 مم. الفراشة الذكور البالغين هو البيج مع الضوء الخافت وعلامات داكنة. أنثى الفراشات تدبير حوالي 20 ملم. الإناث أكثر قتامة من الذكور مع اللون البني / الرمادي.
2. تعليق علبتين من أربع طبقات الورق في قفص لزرع البيضة. بعد 2 أيام، فإن الإناث البالغات وضع البيض على حافة بين الأوراق.
3. مرتين في الأسبوع، ضع البيضة حزم ورقة في صناديق جديدة تربية البلاستيكية التي تحتوي على شبكات للسماح للهواء تعمم، التي تحتوي على حبوب اللقاح وشمع النحل. يفقس البيض في حوالي 3 أيام واليرقات الصغيرة بداية لتطوير طريق تغذية على الشمع وحبوب اللقاح. وبدلا من ذلك، يمكن وضع اليرقات على الغذاء الاصطناعي consistinغرام من مزيج العسل السائل من 500 غرام، 400 غرام الغليسرين، 100 غرام خميرة البيرة المجففة، 250 غرام دقيق القمح، و 200 غرام من مسحوق الحليب الخالي من الدسم و 400 غرام عصيدة من دقيق الذرة. لتوفير نسبة مناسبة من المواد الغذائية في يرقة، فصل بانتظام اليرقات في صناديق جديدة وتجديد الطعام كل يومين.
4. وتربى اليرقات خلال المراحل الست ملعب اليرقة. ويتميز كل ملعب من قبل انزلاق الكبسولة رئيس اليرقات. عندما تصل إلى مرحلة اليرقات قبل التشرنق مشاركة، بحيث يمنعه من التغذية والبدء في بناء شرنقة الحرير الخفيفة.
5. في شرنقتهن واقية، فإن يرقات تتحول إلى الراحة والشرانق. الديدان الشمع تبقى في مرحلة الخادرة لمدة أسبوع أو أسبوعين لنخرج الى العث الكبار. والعث الكبار لا تشرب ولا تأكل. يحدث التزاوج والديدان الشمع دورة "الحياة تبدأ من جديد.
6. لتوحيد فحص الأمراض، واتخاذ اليرقات خلال المرحلة اليرقية الماضي. خلال هذه المرحلة بحيث يمنعه من التغذية، والانتقال إلى غطاء مربع تربية والبدء في إنتاج الحرير. هذا قالمئوية يستمر حوالي 5 أيام.

2. الحشرات اختيار للعدوى

1. حدد مشاركة الطور اليرقات، والتي هي 2-3 سم طويلة و180-250 ملغ في الوزن، وعلى مدار 24 ساعة قبل العدوى ووضعها في علبة فارغة لتجويعهم.
2. إزالة شرنقة الحرير الوليدة حول اليرقات.

3. إعداد البكتيرية

1. إعداد المعلقات البكتيرية العصوية للحصول على تركيزات النهائي تتراوح بين 10 وحدات مستعمرة تشكيل ⁴ (كفو) / مل إلى 10 ⁸ وت م / مل للحقن داخل وhaemocoelic من 3x10 ⁶ وت م / مل إلى 1x10 ⁸ وت م / مل لابتلاع (كفو للحصول على وLD ₅₀ يعتمد على الأنواع البكتيرية). في حالتنا، B. ويزرع في وسط الشمعية مرق لوريا Bertani-(LB، 10 غرام / لتر تريبتون، 5 خلاصة الخميرة ز / لتر، 10 غرام / لتر كلوريد الصوديوم) عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة حتى دخول مرحلة ثابتة، المقابلة لانحناء داخلي للنمو المنحنى. قياس OD 600 نيوتن متر (بين 1 و 2 للB. الشمعية) واستخدامها لتقييم تركيز البكتيريا، وذلك باستخدام منحنى المعايرة التي سبق. خفف الحصاد البكتيريا بواسطة الطرد المركزي عند 5000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و resuspend في الفوسفات المالحة (PBS: 1M KH ₂ PO _4، 1M K ₂ HPO _4، كلوريد الصوديوم 5M، ودرجة الحموضة 7.2). سوف تتلقى كل يرقة 10 ميكرولتر من التعليق البكتيرية في التركيز المطلوب.
2. بدلا من ذلك، أن تكون مستعدة لتعليق بوغ العدوى. الحصول على جراثيم من البكتيريا زراعة في تبوغ HCT المتوسطة (5 ز / L تريبتون، 2 ز / L الكازين حلامة، 12.5 مم K ₂ HPO _4، 12.5 مم MgSO _4، 0.05 ملم MnSO _4، 1.2 مم ZnSO _4، الحديد 1.2 مم ² ₍₄ SO) ^3، 0.5٪ H ₂ SO _4، 25 مم CaCl ₂₎ ²⁰ ° 30 C في مدة 3 أيام. الحصاد الجراثيم بواسطة الطرد المركزي (10،000 XG و 15 دقيقة)، ويغسل مرتين في الماء المقطر المعقم. إعادة تعليق على PEL بوغدعونا في الماء المقطر المعقم والحرارة لمدة 15 دقيقة في 78 ° C لإزالة البكتيريا الخضري المتبقية. أحصى والتعليق من الطلاء التخفيفات المسلسل على لوحات أجار LB. سوف تتلقى كل يرقة 10 ميكرولتر من التعليق بوغ في التركيز المطلوب.

4. البكاء إعداد السمية

1. إعداد السم Cry1C من B. سلالة ثورينجينسيس 407 تتحول مع ال ²¹ pHTF31C بلازميد يحمل الجين الترميز Cry1C. ثقافة السلالة في 100 مل المتوسطة HCT في 30 ° C لمدة 72 ساعة مع المضادات الحيوية (الاريثروميسين 10mg/ml) للسماح تبوغ كامل، إنتاج السم الكريستال والتحرر في طاف الثقافة.
2. تنقية البلورات من طاف على التدرج 72٪ -79٪ سكروز. إضافة أول 17 مل من السكروز 79٪ في أنبوب 40 مل. 17 طبقة بعناية مل من السكروز 72٪ على رأس السكروز 79٪. وأخيرا، طبقة 5-6 مل من ثقافة 10X sporulated المركزة وإغلاق الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 14 ساعة أنبوب في 20،000 XG، 4 ° C، لفصل البلورات من الجراثيم. جمع بلورات في واجهة التدرج. إعادة تعليق بيليه الكريستال في 25 مل من الماء المعقم البارد لغسل عليه. أجهزة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 20 دقيقة. ويتكرر ثلاث مرات هذه الخطوة لإزالة كافة السكروز التمسك البلورات. إعادة تعليق بلورات الماء في 5 مل العقيمة ومراقبة تحت المجهر لتقييم النقاء.
3. تقييم السم تركيز البروتين من تلطيخ برادفورد الكلاسيكية على حل الكريستال presolubilized في هيدروكسيد الصوديوم 50 مم. ويمكن تخزين بلورات السم في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5. حاقن إعداد

1. للسيطرة على حجم الحقن الدقيق، واستخدام مضخة محقنة الآلي (مثل KD العلمية KDS 100) مع سرعة الإعداد إلى 1 ميكرولتر / ثانية (الشكل 1A).
2. ملء حقنة 1 مل تحت الجلد مع 300 ميكرولتر المياه أو الحل البكتيرية (1 حقنة في حالة) للإصابة من 20-25 اليرقات. إزالة الفقاعات التي كتبها تا بعنايةpping الحقنة، ثم نعلق 0،45 X 12 ملم إبرة الحقنة إلى.
3. وضع الحقنة في حاقن.
4. إجراء حقن فارغة من 10 ميكرولتر في أنبوب فارغ للسيطرة على حجم حقن.

6. Intrahaemocoelic حقن الحشرات

1. وضع الحشرات يدويا بين الإبهام والسبابة. ثم أدخل إبرة مثبتة في حاقن في الجلد اليرقة (بشرة) (الشكل 1C).
2. الحفاظ على الحشرات في المكان في حين حقن ال 10 ميكرولتر حل البكتيرية (بكتيريا بوغ أو الخضري).
3. إزالة بعناية الحشرة من الإبرة.
4. وضع الحشرات المصابة في طبق بتري صغيرة (5 سم في القطر)، 5 يرقات لكل طبق.
5. تصيب اليرقات لا يقل عن 20 حالة لكل التجريبية.
6. ضع الأطباق في C ° 37 في حاضنة لمدة 48 ساعة.

7. الحشرات التغذية الإجبارية (الابتلاع)

1. في أنبوب إيبندورف 2 مل، مزيج 0،2 ميكروغرام / م وش؛ لتر من السم Cry1C مع أي تعليق الخلية بوغ أو الخضري للحصول على تركيزات تتراوح بين 3x10 النهائي ⁴ إلى ⁷ في 1x10 10 ميكرولتر.
2. ملء حقنة 1 مل مع 30G، 25 مم إبرة تحت الجلد مع 300 ميكرولتر من الحل السم البكتيري-Cry1C لإصابة اليرقات من 20-25. إزالة الفقاعات من الحقنة.
3. وضع الحشرات يدويا بحيث فمه يدخل إبرة مثبتة في حاقن (1D الشكل)، والتغذية القسرية مع 10 ميكرولتر من الحل البكتيرية باستخدام مضخة محقنة الآلي.
4. تصيب اليرقات لا يقل عن 20 حالة لكل التجريبية.
5. وضع الحشرات المصابة في صغير 5 سم طبق بتري (5 يرقات لكل طبق). ضع الأطباق في C ° 37 في حاضنة لمدة 48 ساعة.

8. تسجيل وفيات الحشرات

1. بعد تجارب التغذية القسرية أو الحقن، والحفاظ على اليرقات في طبق بتري دون طعام عند درجة حرارة 25 مئوية أو 37 درجة مئوية. تحقق اليرقات موrtality بانتظام على مدى فترة 48 ساعة. اليرقات الميتة هي خاملة وعادة ما تتحول الأسود (1B الشكل).
2. ويمكن تحليل البيانات باستخدام برنامج فيات سجل ^{الاحتمالية-14.} هذا البرنامج باختبار الخطي من المنحنيات وفيات الجرعة والجرعة القاتلة يوفر (LD _50). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام برامج أخرى، مثل بريزم (الرسم البياني لوحة)، وتحليل البيانات وفيات أو البقاء على قيد الحياة.

النتائج

haemocoelic الحقن داخل البكتيريا إلى G. وقد ثبت mellonella مفيدة جدا لتحديد عوامل الفوعة التعامل مع العديد من تلف الأنسجة والمقاومة لعوامل المناعة الفطرية من مسببات الأمراض البشرية عدة. على سبيل المثال، يمثل الرقم 2A فيات الحشرات بعد حقن جرعات مختلفة من B.

Discussion

استخدام الحشرات وخاصة مرحلة اليرقات، ونماذج عدة أنواع العدوى، أصبحت متكررة. نموذج المفضل لبعض الجوانب غير ذبابة الفاكهة (ذبابة النموذج) تستخدم كل من البالغين واليرقات ^1،2 المرحلة. الحشرة lepidopteran G. كما تم mellonella تستخدم أساسا لمعايرة الفوعة البكتيري...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	التعليقات (اختياري)
الشمع وحبوب اللقاح	لا كشكش لملابس النساء Roanaise	303000	أي منتج العسل
حقنة الآلي مضخة	KD العلمية	KDS 100
حقنة 1 مل	تيرومو	BS 01T
إبرة 0،45 × 12 مم	تيرومو	NN 2613R
طبق بتري 5 سم	VWR	89000-300
30G إبرة، 25 مم تحت الجلد	Burkard فيبكو المحدودة	PDE0005