El insecto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como un modelo de infección poderosa para investigar la patogénesis bacteriana

Resumen

Haemocolic infección intra oral y de las larvas de la polilla mayor de la cera Galleria mellonella Se describe. Este insecto puede ser usado para estudiar los factores de virulencia de entomopatógeno así como mamíferos bacterias oportunistas. La cría de los insectos, los métodos de infección y ejemplos de In vivo Análisis se describen.

Resumen

El estudio de la virulencia bacteriana a menudo requiere un modelo animal adecuado. Modelos de mamíferos de infección son costosos y pueden plantear cuestiones éticas. El uso de insectos como modelos de infección proporciona una alternativa valiosa. En comparación con otros anfitriones modelo no vertebrados tales como los nematodos, insectos tienen un sistema relativamente avanzado de defensas antimicrobianas y por tanto son más propensos a producir información relevante para el proceso de infección de mamífero. Al igual que los mamíferos, los insectos poseen un complejo sistema inmune innato ^1. Las células en la hemolinfa son capaces de fagocitar o encapsular los invasores microbianos, y las respuestas humorales incluyen la producción inducible de los péptidos antibacterianos de lisozima y ^2,3 pequeño. Además, las analogías se encuentran entre las células epiteliales del intestino medio de larvas de insectos y células intestinales de los sistemas digestivos de mamíferos. Finalmente, varios componentes básicos esenciales para el proceso de infección bacteriana, como la adhesión celular, la resistencia apéptidos antimicrobianos, la degradación del tejido y la adaptación al estrés oxidativo es probable que sean importantes tanto en los insectos y mamíferos ^1. Así, los insectos son herramientas polivalentes para la identificación y caracterización de factores de virulencia microbianos implicados en las infecciones de mamíferos.

Las larvas de la polilla mayor de la cera Galleria mellonella se ha demostrado que proporcionan una información útil sobre la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas, incluyendo hongos de mamífero (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) y los patógenos bacterianos, tales como Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes o Enterococcus faecalis ^4-7. Independientemente de las especies bacterianas, los resultados obtenidos con larvas de Galleria infectados por inyección directa a través de la cutícula se correlaciona necesariamente con los de Similar estudios de mamíferos: las cepas bacterianas que son atenuados en modelos de mamíferos demostrar menor virulencia en Galleria, y las cepas que causan graves infecciones humanas son también altamente virulento en el modelo Galleria ^8-11. Infección oral de la Galleria es mucho menos utilizado y otros compuestos, como toxinas específicas, son necesarios para llegar a la mortalidad.

G. mellonella larvas presentes varias ventajas técnicas: son relativamente grandes (larvas de último estadio antes de la pupación son aproximadamente 2 cm de largo y mg de peso 250), lo que permite la inyección de dosis definidas de bacterias, ya que pueden ser criados a diversas temperaturas (20 ° estudios C a 30 ° C) y la infección puede llevarse a cabo entre 15 ° C a 37 ° C por encima de ^12,13, lo que permite experimentos que imitan un entorno de mamífero. Además, la cría de insectos es fácil y relativamente barato. La infección de las larvas permite monitorizar la virulencia bacteriana por varios medios, including cálculo de LD ₅₀ ^14, la medición de la supervivencia bacteriana ^15,16 y el examen del proceso de infección ^17. Aquí se describe la cría de los insectos, que cubre todas las etapas de vida de G. mellonella. Proporcionamos un protocolo detallado de la infección por dos vías de inoculación: haemocoelic intravaginal. El modelo bacteriano utilizado en este protocolo es Bacillus cereus, un patógeno Gram positivo implicado en gastrointestinal, así como en otras infecciones oportunistas graves local o sistémica ^18,19.

Protocolo

1. La cría de insectos

El ciclo completo de huevo a larvas de último estadio dura alrededor de 5 semanas a 25 ° C. Una o dos semanas adicionales son necesarios para obtener las mariposas adultas.

1. Coloque por lo menos 100 pupas o adultos recién fusionada G. mariposas mellonella en un 5-litros de malla de alambre jaula. Mariposas macho medir 10 a 15 mm. La polilla macho adulto es de color beige con luz tenue y marcas oscuras. Mariposas medida Femenino alrededor de 20 mm. Las hembras son más oscuras que los machos con un color marrón / gris.
2. Suspender dos paquetes de cuatro capas de papel en la jaula para la puesta de huevos. Después de 2 días, la hembra adulta se ponen los huevos en el borde entre los papeles.
3. Dos veces por semana, coloque los paquetes de papel de huevo en las nuevas cajas de crianza de plástico con rejillas para que el aire circule, que contiene polen y cera de abeja. Los huevos eclosionan en unos 3 días y pequeñas larvas comienzan a desarrollarse alimentándose de cera y polen. Alternativamente, larvas se colocan sobre una dieta artificial consisting de una mezcla de miel líquida 500 g, 400 g de glicerina, 100 g de levadura de cerveza seca, harina de trigo 250 g, 200 g de leche en polvo descremada y 400 g polenta. Proporcionar proporción adecuada de alimento por larvas, regularmente separar las larvas en cajas nuevas y reponer la comida cada dos días.
4. Las larvas se crían durante las seis etapas del estadio de larva. Cada estadio se caracteriza por el deslizamiento de la cápsula de la cabeza de las larvas. Cuando las larvas alcanzan la última etapa antes de la pupación, dejan de alimentarse y empezar a construir un capullo de seda.
5. En sus capullos protectores, las larvas se apoyará y se transforman en pupas. Gusanos de cera permanecerá en la fase de pupa de una a dos semanas para emerger en polillas adultas. Las polillas adultas no beber ni comer. El apareamiento se produce y el ciclo de los gusanos de cera "la vida comienza de nuevo.
6. Para estandarizar el ensayo de patología, tomar las larvas durante la etapa larval pasado. Durante esta etapa dejan de alimentarse, moverse a la tapa de la caja de la cría y empezar a producir seda. Este stage dura alrededor de 5 días.

2. Selección de insectos para la infección

1. Seleccione último estadio larvario, que son de 2-3 cm de largo y 180-250 mg de peso, 24 horas antes de las infecciones y los puso en una caja vacía a morir de hambre.
2. Quitar el capullo de seda alrededor de la naciente larvas.

3. Preparación bacteriana

1. Preparar suspensiones bacterianas de Bacillus para obtener concentraciones finales que varían desde 10 ⁴ unidades formadoras de colonias (ufc) / ml a 10 ⁸ ufc / ml para inyección intra haemocoelic y de 3x10 ⁶ ufc / ml a 1x10 ⁸ ufc / ml para la ingestión (el ufc para obtener un LD ₅₀ depende de la especie bacteriana). En nuestro caso, B. cereus se cultiva en medio Luria-Bertani caldo (LB, 10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura, 10 g / l de NaCl) a 37 ° C bajo agitación hasta que la entrada en fase estacionaria, correspondiente a la incurvación del crecimiento curva. Mida las OD 600 nm (entre 1 y 2 por B. cereus) y se utilizan para evaluar la concentración bacteriana, utilizando una curva de valoración previamente hecha. Cosecha bacterias por centrifugación a 5.000 xg durante 10 min a temperatura ambiente y se resuspende en tampón fosfato salino (PBS: 1 M KH ₂ PO _4, 1M K ₂ HPO _4, 5 M NaCl, pH 7,2). Cada larva recibirá 10 l de suspensión bacteriana en la concentración deseada.
2. Alternativamente, la suspensión de esporas se pueden preparar para la infección. Obtener esporas cultivando las bacterias en el medio de esporulación HCT (5 g / L de triptona, 2 g / L de hidrolizado de caseína, 12,5 mM K ₂ HPO _4, 12,5 mM MgSO _4, 0,05 mM MnSO _4, 1,2 mM de ZnSO _4, 1,2 mM Fe ² (SO ₄₎ ^3, 0,5% H ₂ SO _4, 25 mM CaCl ₂₎ ²⁰ a 30 ° C durante 3 días. Esporas cosecha por centrifugación (10.000 xg, 15 min) y lavar dos veces en agua destilada estéril. Resuspender el pel esporasdejar en agua destilada estéril y calor durante 15 min a 78 ° C para eliminar el resto de las bacterias vegetativas. Numerate la suspensión mediante siembra de diluciones seriadas en placas de agar LB. Cada larva recibirá 10 l de suspensión de esporas a la concentración deseada.

4. Preparación de toxina Cry

1. Preparar la toxina Cry1C de la B. thuringiensis cepa 407 transformada con el plásmido ²¹ pHTF31C llevar el gen que codifica Cry1C. Cultivar la cepa en medio HCT 100 ml a 30 ° C durante 72 horas con antibióticos (eritromicina 10mg/ml) para permitir la esporulación completa, la producción de toxina de cristal y la liberación en el sobrenadante del cultivo.
2. Purificar cristales del sobrenadante en un gradiente de sacarosa 72% -79%. En primer lugar añadir 17 ml de 79% de sacarosa en un tubo de 40 ml. Cuidadosamente capa 17 ml de 72% de sacarosa en la parte superior de la sacarosa del 79%. Finalmente, la capa de 5-6 ml del cultivo esporulado concentrado 10 veces y cerrar el tubo. Se centrifuga el tubo durante 14 horas a 20,000 xg, 4 º C, para separar los cristales de las esporas. Recoger los cristales en la interfaz de gradiente. Resuspender el precipitado de cristales en 25 ml de agua estéril fría para lavar. Centrifugar a 8.000 xg durante 20 min. Este paso se repitió tres veces para eliminar todo sacarosa se pegue a los cristales. Resuspender los cristales en 5 ml de agua estéril y observar al microscopio para evaluar la pureza.
3. Evaluar la concentración de toxina de proteína por tinción clásica Bradford en solución de cristal presolubilized en 50 mM NaOH. Cristales de toxina puede ser almacenado a -20 ° C hasta su uso.

5. Inyector de Preparación

1. Para controlar el volumen de inyección precisa, utilizar una bomba de jeringa automatizada (por ejemplo, KD Scientific KDS 100) con una velocidad de configuración a 1 l / seg (Figura 1A).
2. Llene una jeringa de 1 ml hipodérmica con 300 l de agua o la solución bacteriana (1 jeringa por condición) para la infección de larvas de 20-25. Eliminar las burbujas con cuidado tapping la jeringa, después coloque un 0,45 x 12 mm aguja a la jeringa.
3. Coloque la jeringa en el inyector.
4. Realizar una inyección en blanco de 10 l en un tubo de vacío para controlar el volumen inyectado.

6. Inyección Intrahaemocoelic insectos

1. Coloque el insecto manualmente entre el pulgar y el índice. A continuación, insertar la aguja fijada en el inyector en la piel larva (cutícula) (Figura 1C).
2. Mantenga el insecto en su lugar mientras se inyecta la solución 10 l bacteriana (bacterias o esporas vegetativo).
3. Retire con cuidado el insecto de la aguja.
4. Coloque el insecto infectado en una pequeña placa de Petri (5 cm de diámetro), 5 larvas por plato.
5. Infect al menos 20 larvas para cada condición experimental.
6. Colocar las cápsulas a 37 º C en una incubadora durante 48 hr.

7. La alimentación forzada de insectos (Ingestión)

1. En un tubo Eppendorf de 2 ml, mezclar 0,2 g / & mu; l de la toxina Cry1C con cualquiera de suspensión de células o esporas vegetativo para obtener concentraciones finales que van desde 3x10 a 1x10 ^{4 7} por 10 l.
2. Llene una jeringa de 1 ml con un 30 G, 25 mm aguja hipodérmica con 300 l de la solución de toxina bacteriana-Cry1C en la infección de larvas de 20-25. Eliminar las burbujas de la jeringa.
3. Coloque el insecto manualmente de modo que su boca entra en la aguja fija en el inyector (Figura 1D), y alimentar a la fuerza con 10 l de la solución bacteriana usando la bomba de jeringa automatizada.
4. Infect al menos 20 larvas para cada condición experimental.
5. Coloque el insecto infectado en un pequeño plato Petri de 5 cm (5 larvas por plato). Colocar las cápsulas a 37 º C en una incubadora durante 48 hr.

8. Grabación de la mortalidad de insectos

1. Después de los experimentos de alimentación forzada o de inyección, mantener las larvas en la placa de Petri sin alimento a 25 ° C o 37 ° C. Compruebe larval mortality regularmente durante un período de 48 horas. Larvas muertas son inertes y por lo general vuelve negro (fig. 1B).
2. Los datos de mortalidad se pueden analizar utilizando el programa de log-probit ^14. Este programa pone a prueba la linealidad de las curvas de mortalidad de dosis y proporciona dosis letales (LD _50). Alternativamente, otros programas, tales como Prism (Graph Pad), analizando la supervivencia o los datos de mortalidad se puede utilizar.

Resultados

Inyección Intra haemocoelic de bacterias en G. mellonella ha demostrado ser muy útil para la identificación de factores de virulencia que se ocupan de los daños y la resistencia a los factores inmunes innatas de varios patógenos humanos. Como ejemplo, la figura 2A representa mortalidad de los insectos después de la inyección de varias dosis de B. bacterias cereus (tipo salvaje y cepas mutantes) ^22. Figura 2B representa la supervivencia bacter...

Discusión

El uso de insectos y especialmente la etapa larval, como modelos de infección para los varios patógenos, se está convirtiendo frecuente. Un modelo de elección para algunos aspectos es Drosophila (mosca del modelo) que se utiliza como adultos y ^1,2 etapa larval. El insecto lepidóptero G. mellonella también se ha utilizado principalmente para ensayar la virulencia bacteriana por inyección. La ventaja de tolerar temperaturas más altas (por encima de 37 ° C) que en Drosophila (...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Cera y polen	La Ruche Roanaise	303000	Los productores de miel
Bomba de jeringa automatizada	KD Scientific	KDS 100
Jeringa 1 ml	Terumo	BS 01T
Aguja de 0,45 x 12 mm	Terumo	NN 2613R
Placa de Petri de 5 cm	VWR	89000-300
Aguja 30G, 25 mm hipodérmica	Burkard Mfg Co. Ltd.	PDE0005