Böcek<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bakteriyel Patogenez İnceleyecek Güçlü Enfeksiyon Model olarak

Özet

Büyük bal mumu güvesi larvalarının Ağız ve intra haemocolic enfeksiyonu Galleria mellonella Tarif edilmektedir. Bu böcek entomopatojenik hem de memeli fırsatçı bakteri virülans faktörü incelemek için kullanılabilir. Enfeksiyon yöntemleri ve örnekleri, böceklerin yetiştirilmesi In vivo Analiz tarif edilmektedir.

Özet

Bakteriyel ölümcüllüğün çalışması genellikle uygun bir hayvan modeli gerektirir. Enfeksiyon Memeli modelleri pahalı ve etik sorunlar doğurabilir. Enfeksiyon modelleri olarak böceklerin kullanımı değerli bir alternatif sunuyor. Bu tür nematod gibi diğer non-omurgalı modeli ana karşılaştırıldığında, böcekler antimikrobiyal savunma nispeten gelişmiş sisteme sahip ve böylece daha fazla memeli enfeksiyon süreci ile ilgili bilgi üretmek olasıdır. Memeliler gibi, böcekler karmaşık bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi ¹ sahiptirler. Hemolimf hücreler mikrobik işgalciler phagocytosing veya encapsulating yeteneğine sahiptir ve hümoral yanıtlar lizozim ve küçük antibakteriyel peptidler ^2,3 indüklenebilir üretimini içermektedir. Buna ek olarak, görevdeş böcek larva sindirim sistemleri ve memeli sindirim sistemi bağırsak hücrelerinin epitelyal hücreleri arasında bulunur. Son olarak, hücre adezyonu, direnç olarak bakteriyel enfeksiyon süreci için gerekli birkaç temel bileşenlerantimikrobiyal peptidler, doku bozulması ve oksidatif strese adaptasyon böcekler ve memeliler ¹ hem de önemli olması muhtemeldir. Böylece, böceklerin memeli enfeksiyonlar dahil Mikrobiyal virulans faktörlerinin belirlenmesi ve tanımlanması için çok değerlikli araçlardır.

Büyük bal mumu güvesi Galleria mellonella larvaları gibi Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris gibi memeli mantar (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) ve bakteriyel patojenler içeren mikrobiyal enfeksiyonlar, geniş bir yelpazede patogenezinde dair yararlı bir içgörü sağlamak için gösterilmiştir , Serratia Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes ve Enterococcus faecalis ^4-7. Ne olursa olsun bakteri türlerinin, sonuçlar manikür yoluyla direkt enjeksiyonu ile enfekte Galleria larvaları ile tutarlı simi olanlar ile korele eldelar memeli çalışmaları: memeli modelleri zayıflatılmış olan bakteri suşları Galleria düşük virulans göstermek ve ciddi insan enfeksiyonlarına yol açan suşların Galleria modeli ^8-11 oldukça kışkırtıcı. Galleria Oral enfeksiyon, belirli toksinler gibi, çok daha az kullanılan ve bileşikler ilave edilir mortalite ulaşmak için ihtiyaç vardır.

G. mellonella larvaları mevcut birçok teknik avantajları: böylece bakteri tanımlanmış dozlarda enjeksiyonu sağlayan, (pupa devresi öncesi son evre larvaları yaklaşık 2 cm uzunluğunda ve ağırlığı 250 mg vardır) nispeten büyük; 20 (değişik sıcaklıklarda yetiştirilen olabilir ° 30 ° C-C) ve enfeksiyon çalışmalar, bir memeli ortam taklit deneyler sağlar, 37 ° C üstünde ^12,13 ile 15 ° C arasında yürütülebilir. Buna ek olarak, böcek yetiştirme basit ve nispeten ucuz. Larvaların Enfeksiyon çeşitli yollarla, includin bakteriyel virülans izleme sağlarLD ₅₀ ¹⁴ g hesaplanması, bakteriyel sağkalım ^15,16 ve enfeksiyon süreci ¹⁷ muayene ölçümü. Burada, G. tüm yaşam evrelerinde kapsayan, böceklerin yetiştirme tarif mellonella. Oral ve intra haemocoelic: Biz inokülasyon iki güzergah enfeksiyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokolde kullanılan bakteri örnek Bacillus cereus, mide-bağırsak yanı sıra diğer ağır lokal ya da sistemik fırsatçı enfeksiyonlar ^18,19 karışmış bir Gram pozitif patojendir.

Protokol

1. Böcek Yetiştirme

Yumurtadan son evre larvalar için tüm döngü 25 ° C'de yaklaşık 5 hafta sürer Bir ya da 2 hafta daha yetişkin kelebekleri elde etmek için gereklidir.

1. En az 100 pupa veya yeni birleştirilen yetişkin G. yerleştirin 5 litrelik tel örgü kafes mellonella kelebekler. Erkek kelebekleri 10 ila 15 mm ölçer. Yetişkin erkek güve soluk ışık ve koyu işaretler ile bej olduğunu. 20 mm çapında Dişi kelebekler ölçüsüdür. Dişiler kahverengi / gri renk ile erkeklerden daha koyu vardır.
2. Yumurta-döşenmesi için kafes içinde dört katmanlı kağıt, iki paket süspanse edin. 2 gün sonra, erişkin dişi kağıtları arasındaki kenarında yumurtalarını olacaktır.
3. Haftada iki kez, polen ve arı balmumu içeren, hava sirkülasyonu izin ızgaraları ile yeni plastik yetiştirme kutularında yumurta kağıt paketlerini yerleştirin. Yumurtalar yaklaşık 3 gün içinde yumurtadan ve küçük larva balmumu ve polen beslenerek gelişmeye başlar. Alternatif olarak, yapay larva bir diyet consistin yerleştirilebilir500 g sıvı bal, gliserin 400 g, 100 g kurutulmuş bira mayası, 250 g buğday unu, 200 g yağsız süt tozu ve 400 g polenta bir karışımı g. Larva başına gıda uygun oranı sağlamak için, düzenli olarak yeni kutular içine larva ayırmak ve her iki günde bir yiyecek doldurmak.
4. Larva larva stadyum altı aşamalarında yetiştirilir. Her bir stadyum larva baş kapsül kayması ile karakterize edilir. Larvalar pupa devresi önceki son aşamaya ulaşmak zaman, onlar besleme durdurmak ve hafif ipek kozası oluşturmaya başlayabilirsiniz.
5. Onların koruyucu koza içinde, larva dinlendirir ve pupa haline dönüştürmek. Wax solucanlar erişkin kelebekleri ortaya bir iki hafta için pupa kalır. Yetişkin güveler içki de yemem. Çiftleşme oluşur ve balmumu solucanlar 'yaşam döngüsü tekrar başlar.
6. Patoloji testi standardize etmek için, son larva aşamasında larvaları alır. Bu aşamada onlar besleme durdurmak, yetiştirme kutusunun kapağını taşımak ve ipek üretmeye başlarlar. Bu stage 5 gün civarında sürer.

2. Enfeksiyon için Böcek Seçimi

1. Enfeksiyonlar öncesi son dönem ağırlığı 2-3 cm uzunluğunda ve 180-250 mg olan larva, 24 saat seçin ve onları açlıktan boş bir kutu içine koymak.
2. Larvaları etrafında doğmakta ipek kozası çıkarın.

3. Bakteriyel Hazırlık

1. Kob / ml 1x10 ⁸ kob / yenmesi için ml (kob elde etmek için 10 ⁴ koloni oluşturan birim (cfu) / ml 'den 10 ⁸ kob / intra haemocoelic enjeksiyon ml ve 3x10 ⁶ arasında değişen nihai konsantrasyonlar elde etmek için Bacillus bakteriyel süspansiyonlar hazırlayın bir LD ₅₀₎ bakteri türlerine bağlıdır. Bizim durumumuzda, B. cereus 'un Luria-Bertani broth ortamda yetiştirilir (LB, 10 g / L tripton, 5 g / l maya ekstresi, 10 g / l NaCl) 37 ° C' de karıştırma altında kadar büyüme eğrilme karşılık gelen durağan faz girmesi eğrisi. OD 600 nm (ölçünB. 1 ila 2 cereus) ve daha önceden yapılmış titrasyon eğrisi kullanarak bakteriyel konsantrasyon değerlendirmek için kullanabilirsiniz. Oda sıcaklığında ve fosfat içinde tekrar süspansiyon 10 dakika için 5000 x g'de santrifüj ile hasat bakteriler (: 1M KH ₂ PO _4, 1M K ₂ HPO _4, 5M NaCl, pH 7.2 PBS) Tamponlu Tuzlu. Her bir larva istenen konsantrasyonda bakteriyel süspansiyon 10 ml alır.
2. Alternatif olarak, spor süspansiyonu enfeksiyon için hazırlanabilir. Sporlanma orta HCT (5 g / L tripton, 2 g / L kazein hidrolizat, 12.5 mM K ₂ HPO _4, 12.5 mM _MgSO4, 0.05 mM MnSO _4, 1.2 mM ZnSO _4, 1.2 mM Fe kültür bakterileri tarafından sporların Edinme ² _(SO4) ^3,% 0.5 _H2 3 gün süre ile 30 ° C 'de, 25 mM _CaCl2) ^20, ₄ SO. Hasat santrifüj tarafından sporların (10,000 xg, 15 dk), ve steril distile su içinde iki kez yıkayın. Spor pel süspanseKalan vejetatif bakteriler kaldırmak için 78 az 15 dakika ° C için steril distile su ve ısı sağlar. LB agar plaklarına seri dilüsyonları kaplama ile süspansiyon numaralamak. Her bir larva istenen konsantrasyonda spor süspansiyonu 10 ml alır.

4. Toksin Hazırlık Cry

1. B. Cry1C toksin hazırlayın thuringiensis suşu 407, geninin kodlama Cry1C taşıyan plazmid pHTF31C ²¹ ile dönüştürülebilir. 30 100 ml HCT ortam içinde kültür suşu ° ile 72 saat süre ile tam sporlanma C, kültür yüzey maddesinde kristal toksin üretimi ve kurtuluş sağlamak için (eritromisin 10mg/ml) antibiyotik.
2. 72% -79% sakkaroz degradede süpernatantı kristalleri arındırın. İlk olarak, bir 40 ml tüp içinde% 79 sakaroz 17 ml eklenir. % 79 sakkaroz üstüne% 72 sakkaroz dikkatlice tabakası 17 ml. Son olarak, katman 5-6 10X konsantre sporlu kültür ml tüp kapatın. 20,00 az 14 saat boyunca tüp Santrifüj0 xg, 4 ° C, sporlar kristaller ayırmak için. Degrade arayüzü kristalleri toplayın. Yıkamak için 25 ml soğuk steril su içinde kristal pelet yeniden süspanse edin. 20 dakika için 8000 x g'de santrifüjleyin. Bu adım, kristaller yapışmasını tüm sakaroz çıkarmak için üç kez tekrarlanır. 5 ml steril su içinde yeniden süspanse edin ve kristallerin saflığı değerlendirmek için mikroskop altında dikkate alınmalıdır.
3. 50 mM NaOH içinde presolubilized kristal çözüm üzerinde klasik Bradford boyama ile toksin protein konsantrasyonu değerlendirin. Toksin kristaller, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

5. Enjektör Hazırlık

1. Hassas enjeksiyon hacmi kontrol etmek için, 1 ul / sn (Şekil 1A) kurulum hızı ile otomatik şırınga pompası (örn. KD Scientific KDS 100) kullanın.
2. 300 ul su ile 1 ml derialtı şırınga veya 20-25 larva enfeksiyon bakteri solüsyonu (koşul başına 1 şırınga) doldurun. Dikkatle ta tarafından kabarcıklarını çıkarınşırınga pping, daha sonra şırınga ile bir 0.45 x 12 mm iğne ekleyin.
3. Enjektör içinde enjektör yerleştirin.
4. Enjekte ses seviyesini kontrol etmek boş bir tüp içinde 10 ul boş bir enjeksiyon gerçekleştirin.

6. Böcek Intrahaemocoelic Enjeksiyon

1. Başparmak ve işaret parmağı arasında elle böcek yerleştirin. Sonra Larva deri (epiderm) (Şekil 1C) olarak enjektör sabit iğne takın.
2. 10 ul bakteriyel solüsyonu (spor veya vejetatif bakteriler) enjekte ederken yerde böcek tutun.
3. Dikkatlice iğne böcek çıkarın.
4. Küçük bir Petri kabı (çapı 5 cm), tabak başına 5 larvaları enfekte böcek yerleştirin.
5. Her bir deneysel koşul için en az 20 larva Infect.
6. 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de bulaşık yerleştirin.

7. Böcek Kuvvetleri Besleme (Yutma)

1. 2 ml Eppendorf tüp, 0.2 mikrogram / & m mixu; ya da spor veya vejetatif hücre süspansiyonu ile Cry1C toksin l 3x10 ^{4 ila} 10 ul başına 1x10 ⁷ arasında değişen nihai konsantrasyonlar elde edilmiştir.
2. 20-25 larva enfeksiyon için bakteriyel-Cry1C toksin çözelti 300 ul, bir 30G ile 25 mm hipodermik iğne bir 1 ml'lik şırınga doldurun. Şırıngadan kabarcıklarını çıkarın.
3. Elle yüzden onun ağzından iğne (Şekil 1D) enjektör sabit ve otomatik şırınga pompası kullanılarak bakteri solüsyonu 10 ml ile zorla beslemek girdiği böcek yerleştirin.
4. Her bir deneysel koşul için en az 20 larva Infect.
5. Küçük 5 cm Petri kabı (tabak başına 5 larva) olarak enfekte böcek yerleştirin. 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de bulaşık yerleştirin.

8. Kayıt ve böceklerin ölüm

1. Zorla besleme veya enjeksiyon deneylerden sonra, 25 gıda olmadan Petri kabındaki larvalar tutmak ° C veya 37 ° C Larva mo Giriş48 saat süre boyunca düzenli rtality. Ölü larvalar inerttir ve genellikle siyah (Şekil 1B) çevirin.
2. Mortalite verileri log-probit programı ¹⁴ kullanılarak analiz edilebilir. Bu program doz ölüm eğrileri doğrusallık testleri ve öldürücü doz (LD ₅₀₎ sağlar. Alternatif olarak, Prism (Grafik Pad), sağkalım analiz veya mortalite verileri gibi diğer programlar, kullanılabilir.

Sonuçlar

G. içine bakteri içi enjeksiyon haemocoelic mellonella birçok insan patojenleri doğuştan gelen bağışıklık faktörleri doku hasarına ve direniş ile ilgili birçok virülans faktörlerinin tanımlanması için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir örnek olarak, Şekil 2a, b, çeşitli doz enjeksiyonundan sonra Böcek ölümleri temsil eder cereus bakterisi (yabani tip ve mutant suşlar) ^22. Şekil 2B G. enfeksiyo...

Tartışmalar

Böceklerin ve özellikle larva olarak kullanımı, birçok patojen enfeksiyon modelleri olarak, sık hale gelmektedir. Bazı yönleri için seçim modeli yetişkin ve larva aşamasında ^1,2 ikisi olarak kullanılan Drosophila (sinek modeli) olduğunu. Lepidopteran böcek G. mellonella, aynı zamanda esas olarak enjeksiyon yoluyla bakteriyel virülans test edilmesi için kullanılmıştır. Memeli patojenlere çalışılan yok edilmesi gerektiği zaman, Drosophila daha yüksek sıca...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Wax ve polen	La Ruche Roanaise	303000	Herhangi bir bal üreticisi
Otomatik şırınga pompası	KD Scientific	KDS 100
1 ml şırınga	Terumo	BS 01T
İğne 0.45 x 12 mm	Terumo	NN 2613R
Petri 5 cm	VWR	89000-300
İğne 30G, 25 mm derialtı	Burkard Mfg Co Ltd	PDE0005