החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

Summary

זיהום haemocolic אוראלי ותוך של זחלים של עש השעווה הגדולה יותר גלרית mellonella הוא תאר. חרק זה יכול לשמש כדי לחקור גורמים ארסיים של entomopathogenic כמו גם חיידקים אופורטוניסטים יונקים. גידול של החרקים, שיטות של זיהום ודוגמאות של In vivo ניתוח מתואר.

Abstract

המחקר של חיידקים ארסיים לעתים קרובות מחייב מודל חיה מתאימה. מודלי יונקים של זיהום הם יקרים ועשויים להעלות סוגיות אתיות. השימוש בחרקים כמודל לזיהום מספק חלופה רבה ערך. בהשוואה למארחי מודל שאינם בעלי חוליות אחרים, כגון נמטודות, חרקים יש מערכת מתקדמת יחסית של הגנות מיקרוביאלית ולכן הם נוטים יותר להפקת מידע רלוונטי לתהליך ההדבקה של יונקים. כמו יונקים, חרקים בעלי מערכת חיסון מולדת מורכבת ^1. תאים בhemolymph מסוגלים phagocytosing או encapsulating פולשי מיקרוביאלי, ותגובות הומורלית כוללות ייצור המושרה של פפטידים Lysozyme והקטנים אנטיבקטריאליות ^2,3. בנוסף, אנלוגיות נמצאות בין תאי האפיתל של midguts זחל חרקים ותאי מעי מערכת עיכול של יונקים. לבסוף, מספר מרכיבים בסיסיים חיוניים לתהליך זיהום החיידקים כגון הידבקות תא, התנגדותפפטידים מיקרוביאלית, ניוון רקמות ואת ההסתגלות לסטרס חמצונים, סביר שיהיה חשוב בשני חרקים ויונקים ^1. לכן, חרקים הם כלים רבים ערכיים לזיהוי והאפיון של גורמים ארסיים מיקרוביאלי המעורב בזיהומים ביונקים.

זחלים של העש הגדול שעוות Galleria mellonella הוכחו לספק תובנה שימושית לפתוגנזה של מגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים כוללים פטרייתי יונקים (Fusarium oxysporum, אספרגילוס fumigatus, קנדידה אלביקנס) וחיידקים פתוגנים, כגון סטפילוקוקוס אוראוס, vulgaris פרוטאוס , Aeruginosa Serratia marcescens Pseudomonas, monocytogenes יסטריה או Enterococcus faecalis ^4-7. ללא קשר למיני חיידקים, תוצאות שהושגו עם זחלי Galleria הנגועים על ידי הזרקה ישירה דרך העור המת באופן עקבי לתאם עם אלה של סימיlar מחקרי יונקים: זני חיידקים שנחלשו במודלים של יונקים להפגין אלימות נמוכה בגלריה, וזני גרימת זיהומי אדם חמורים גם ארסיים ביותר במודל Galleria ^8-11. דלקת פה של גלריה היא הרבה פחות משומשת ותרכובות נוספות, כמו רעלים מסוימים, יש צורך להגיע לתמותה.

מספר יתרונות G. mellonella זחלים נוכחיים טכניים: הם גדולים יחסית (זחלי instar אחרונים לפני ההתגלמות הם 250 מ"ג משקל ארוכים בערך 2 סנטימטר ו), ובכך מאפשר הזרקה של מנות מוגדרות של חיידקים, הם יכולים להיות שגדלו בטמפרטורות שונות (20 מעלות C עד 30 ° C) וזיהום מחקרים יכולים להתנהל בין 15 ° C למעל 37 מעלות צלזיוס ^12,13, המאפשרים ניסויים המחקים סביבה של יונקים. בנוסף, גידול חרקים הוא קל וזול יחסית. זיהום של הזחלים מאפשר ניטור ארסיות חיידקים על ידי מספר אמצעים, includinחישוב גרם של LD ₅₀ ^14, מדידה של הישרדות חיידקים ^15,16 ובחינה של תהליך ההדבקה ^17. כאן, אנו מתארים את הגידול של החרקים, המכסים את כל שלבי החיים של ג mellonella. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של זיהום על ידי שני מסלולים של חיסון: haemocoelic פה ופנים. מודל החיידקים השתמש בפרוטוקול זה הוא cereus Bacillus, הפתוגן גראם חיובי מעורבים במערכת עיכול כמו גם בזיהומים אחרים חמורים מקומיים או מערכתיים אופורטוניסטיים ^18,19.

Protocol

1. חקר גידול חרקים

כל מחזור מביצה לזחלי instar האחרונים נמשך כ 5 שבועות ב 25 ° C. אחד או 2 שבועות נוספים נדרשים כדי להשיג פרפרים בוגרים.

1. הנח לפחות 100 גלמים או התמזג מבוגר לפתע ג פרפרי mellonella בכלוב 5-ליטר חוט תיל. פרפרי זכרים למדוד 10-15 מ"מ. עש זכר הבוגר הוא בצבע בז' עם אור קלוש וסימנים כהים. מדד פרפרים נקבה סביב 20 מ"מ. נקבות כהות יותר זכרים בעלי צבע חום / אפור.
2. להשעות את שתי חבילות של נייר ארבע שכבות בכלוב להטלת ביצים. לאחר 2 ימים, הנקבה הבוגרת תטיל את ביצים על הקצה בין העיתונים.
3. פעמים בשבוע, להניח את חבילות ביצי נייר בתיבות גידול פלסטיק חדשות עם רשתות כדי לאפשר לאוויר לזרום, המכיל אבקת פרחים ושעוות דבורים. ביצים בוקעות בכ 3 ימים וזחלים קטנים להתחיל לפתח על ידי האכלה בשעווה ואבקת פרחים. לחלופין, זחלים ניתן להציב על דיאטת consistin מלאכותיגרם של תערובת של דבש 500 גרם נוזלי, גליצרין 400 גרמו, שמרי בירה מיובשים 100 גרם, קמח חיטה 250 גרם, אבקת חלב דל שומן 200 גרם וגרם פולנטה 400. כדי לספק יחס המתאים של אוכל לזחל, להפריד באופן קבוע את הזחלים לתוך תיבות חדשות ולחדש את האוכל כל ימים.
4. זחלים גדלים במהלך השישה השלבים של אצטדיון זחל. כל אצטדיון מתאפיין בגלישה של הקפסולה הראש של זחלים. כאשר זחלים מגיעים לשלב האחרון לפני ההתגלמות, הם מפסיקים האכלה ולהתחיל לבנות את פקעת משי אור.
5. בגלמי מגנם, הזחלים ינוחו ולהפוך לגלמים. תולעי שעווה יישארו בשלב הגולם ל1-2 שבועות כדי לצאת לעשים בוגרים. העש הבוגר לא שותה ולא אוכל. הזדווגות מתרחשת ומחזור החיים של תולעי השעווה מתחיל שוב.
6. כדי לתקן את assay פתולוגיה, לקחת את הזחלים בשלב הזחל האחרון. בשלב זה הם מפסיקים האכלה, לעבור לכיסוי של תיבת גידול ולהתחיל לייצר משי. זו שלאחוז נמשך סביב 5 ימים.

2. בחירת חרק לזיהום

1. בחר הזחלים אחרונים instar, שהם ארוכים 2-3 סנטימטר ו180-250 מ"ג במשקל, 24 שעות לפני הזיהומים והכנסת אותם לתוך תיבה ריקה להרעיב אותם.
2. הסר את פקעת המשי מתהווה סביב הזחלים.

3. הכנת קטריאלי

1. הכן השעיות Bacillus חיידקים להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין 10 ⁴ יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מ"ל ל10 ⁸ CFU / מ"ל להזרקה תוך וhaemocoelic מ3x10 ⁶ CFU / מ"ל ל1x10 ⁸ CFU / מ"ל לבליעה (CFU להשיג LD ₅₀ תלוי במיני החיידקים). במקרה שלנו, ב ' cereus גדל במדיום מרק לוריא-Bertani (LB, 10 גרם / ליטר tryptone, שמרי תמצית 5 גרם / הליטר, 10 גר '/ ליטר NaCl) על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה עד שלב כניסה לנייח, המקבילה לincurvation של הצמיחה עקומה. מדוד את 600 nm (ODבין 1 ו 2 לB. cereus) ולהשתמש בו כדי להעריך את ריכוז חיידקים, תוך שימוש בעקומת טיטרציה עשתה בעבר. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 5000 למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר וresuspend בנאגרו מלוחים פוספט (PBS: 1M KH ₂ PO _4, 1M K ₂ HPO _4, NaCl 5M, 7.2 pH). כל זחל יקבל 10 μl של השעית חיידקים בריכוז הרצוי.
2. לחלופין, השעית נבג יכולה להיות מוכנה להדבקה. השג נבגים ידי culturing את החיידקים בנביגה הבינונית HCT (5 גר '/ L tryptone, 2 גרם / ליטר קזאין hydrolyzate, 12.5 המ"מ K _{2 4} HPO, 12.5 המ"מ ₄ MgSO, 0.05 המ"מ ₄ MnSO, ​​1.2 המ"מ ₄ ZnSO, 1.2 מ"מ פה ² (SO ₄₎ ^3, 0.5% H ₂ SO _4, 25 המ"מ CaCl ₂₎ ²⁰ ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. נבגי קציר על ידי צנטריפוגה (10000 XG, 15 דקות), ולשטוף פעמים במים מזוקקים סטריליים. Resuspend הנבג PELבואו במים מזוקקים סטריליים וחום במשך 15 דקות ב78 ° C כדי להסיר חיידקים וגטטיבי נותרים. מנות השעיה על ידי ציפוי דילולים סידוריים על צלחות אגרו LB. כל זחל יקבל 10 μl של השעית נבגים בריכוז הרצוי.

4. Cry הכנת רעלן

1. הכן את רעל Cry1C מB. מתח thuringiensis 407 הפך עם pHTF31C ²¹ פלסמיד שנשאו את Cry1C הקידוד הגנטי. תרבות הזן במדיום 100 מ"ל HCT ב 30 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם אנטיביוטיקה (אריתרומיצין 10mg/ml) כדי לאפשר נביגה מלאה, ייצור הרעלן גביש ושחרור בsupernatant התרבות.
2. לטהר את גבישים מאת supernatant על -79% 72% שיפוע סוכרוז. ראשית להוסיף 17 מ"ל של סוכרוז 79% בצינור מ"ל 40. זהירות 17 מיליליטר שכבה של סוכרוז 72% על גבי סוכרוז 79%. לבסוף, 5-6 מיליליטר השכבה של תרבות sporulated המרוכזת 10X ולסגור את הצינור. צנטריפוגה לצינור 14 שעות ב20,000 XG, 4 ° C, כדי להפריד את הגבישים מהנבגים. לאסוף את הגבישים בממשק שהשיפוע. Resuspend גביש הגלולה במים סטריליים קרים 25 מ"ל לשטוף אותו. צנטריפוגה XG ב 8000 עבור 20 דקות. צעד זה חוזר על עצמו שלוש פעמים כדי להסיר את כל סוכרוז היצמדות לגבישים. Resuspend את הגבישים במי 5 מ"ל סטרילי ולבחון תחת מיקרוסקופ להעריך טוהר.
3. הערך את ריכוז חלבון רעלן על ידי צביעה הקלסית ברדפורד בפתרון הגביש presolubilized ב50 mM NaOH. גבישי רעלן ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש.

5. Injector הכנה

1. כדי לשלוט בעוצמת קול ההזרקה המדויקת, השתמש במשאבת מזרק אוטומטית (למשל KD המדעי KDS 100) עם מהירות התקנה לμl 1 / שני (איור 1 א).
2. מלא מזרק 1 מיליליטר מזרק עם מי μl 300 או פתרון החיידקים (מזרק 1 לכל מצב) לזיהום של 20-25 זחלים. הסר את הבועות על ידי זהירות ת"אpping המזרק, אז לצרף מחט מ"מ 0.45 x 12 למזרק.
3. הנח את המזרק במזרק.
4. לבצע הזרקה ריקה של 10 μl בצינור ריק לשלוט נפח המוזרק.

6. הזרקת Intrahaemocoelic חרקים

1. הנח את החרקים באופן ידני בין האגודל לאצבע. לאחר מכן, הכנס את מחט המזרק קבוע בעור הזחל (קוטיקולה) (התרשים 1C).
2. שמור את החרק במקום בזמן הזרקת 10 פתרון חיידקי μl (חיידקי נבגים או צמח).
3. מוציא בזהירות את החרק מהמחט.
4. הנח את החרק הנגוע בצלחת פטרי קטנה (5 סנטימטרי קוטר), 5 זחלים למנה.
5. להדביק לפחות 20 זחלים לכל תנאי ניסוי.
6. מניח את המנות על 37 מעלות צלזיוס בחממה על 48 שעות.

7. הלעטת חרקים (בליעה)

1. בצינור 2 מ"ל אפנדורף, לערבב 0.2 מיקרוגרם / & מ 'u; הליטר של רעל Cry1C גם עם השעית תא נבג או צמח להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין ⁴ ל 3x10 1x10 ⁷ לכל 10 μl.
2. מלא מזרק 1 מ"ל עם 30G, מזרק 25 מ"מ עם 300 μl של פתרון רעלן של חיידקים-Cry1C להדבקת 20-25 זחלים. הסר את הבועות מהמזרק.
3. הנח את החרקים באופן ידני, כך שהפה שלו נכנס המחט קבועה במזרק (1D איור), ולהאכיל אותו בכוח עם 10 μl של פתרון החיידקים באמצעות משאבת המזרק האוטומטית.
4. להדביק לפחות 20 זחלים לכל תנאי ניסוי.
5. הנח את החרק הנגוע בקטנה 5 סנטימטר צלחת פטרי (5 זחלים למנה). מניח את המנות על 37 מעלות צלזיוס בחממה על 48 שעות.

8. תמותת חרקי הקלטה

1. לאחר ניסויי כוח האכלה או הזרקה, לשמור את הזחלים בצלחת פטרי בלי אוכל ב 25 ° C או 37 ° C. בדקו הזחל מוrtality אופן קבוע על פני תקופת שעה 48. זחלי מלח הם אינרטי ובדרך כלל הופכים שחור (האיור 1B).
2. נתוני תמותה ניתן לנתח באמצעות תכנית היומן ^Probit-14. תכנית זו בוחנת את הליניאריות של עקומות תמותת מינון ומספקת כמות קטלנית (LD _50). לחלופין, תוכניות אחרות, כמו פריזמה (הגרף Pad), ניתוח נתוני תמותה או הישרדות יכולות לשמש.

תוצאות

הזרקה תוך haemocoelic של חיידקים לג mellonella הוכח שימושי מאוד לזיהוי גורמים ארסיים רבים העוסקים בניזק לרקמות והתנגדות לגורמים חיסוניים מולדים של כמה פתוגנים אנושיים. כדוגמה, 2A הדמות מייצג תמותת חרקים לאחר הזרקה של מינונים שונים של B. חיידקי cereus (סוג פר...

Discussion

השימוש בחרקים ובמיוחד בשלב הזחל, כמודלים לזיהום כמה פתוגנים, הופך תכוף. מודל של בחירה בהיבטים מסוימים הוא דרוזופילה (מודל הזבוב) משמשת כמבוגרים ^ו1,2 שלב זחל. Lepidopteran החרקים ג mellonella גם שמש בעיקר לassaying ארסיות חיידקים בהזרקה. היתרון של לסבול טמפרטורות גבוהו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
שעווה ואבקה	La Ruche Roanaise	303000	כל יצרן הדבש
משאבת מזרק אוטומטית	KD מדעי	KDS 100
מזרק 1 מ"ל	Terumo	BS 01T
0.45 x 12 מ"מ מחט	Terumo	NN 2613R
צלחת פטרי 5 סנטימטר	VWR	89000-300
30G מחט, מזרק 25 מ"מ	Burkard Mfg. בע"מ	PDE0005