곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

요약

큰 왁스 나방의 애벌레의 구강 내부 haemocolic 감염 갤러리아 mellonella이 설명되어 있습니다. 이 벌레는 entomopathogenic뿐만 아니라 포유류의 기회 박테리아의 독성 요인을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 감염 방법과의 예는 곤충의 양육 생체 내 분석에 설명되어 있습니다.

초록

박테리아 독성의 연구는 종종 적절한 동물 모델이 필요합니다. 감염의 포유류의 모델은 비용이 많이 들고 있으며, 윤리적 문제를 제기 할 수 있습니다. 감염 모델과 같은 곤충의 사용은 가치있는 대안을 제공합니다. 같은 nematodes와 같은 다른 비 척추 동물 모델 호스트에 비해 곤충은 항균 방어 비교적 고급 시스템을 가지고 있으며 따라서 더 포유류의 감염 과정에 관련 정보를 생성 할 가능성이 있습니다. 포유 동물과 마찬가지로, 곤충은 복잡한 타고난 면역 시스템 ^1을 보유하고 있습니다. hemolymph에있는 세포 미생물 침략자를 phagocytosing하거나 캡슐화 할 수 있으며, 체액 반응은 라이소자임 작은 항균 펩티드 ^2,3의 inducible 생산이 포함되어 있습니다. 또한, 유추는 곤충 애벌레의 midguts와 포유류의 소화 시스템의 장 세포의 상피 세포 사이에 발견된다. 마지막으로, 이러한 세포 부착, 저항 등의 세균 감염 과정에 필수적인 몇 가지 기본 구성 요소항균 펩티드, 조직 저하 및 산화 스트레스에 대한 적응은 곤충과 포유류 ^한 모두에 중요 할 가능성이 있습니다. 따라서, 곤충 포유류의 감염에 관련된 미생물 독성 요소의 식별 및 특성에 대한 여러 균을 혼합 한 도구입니다.

큰 왁스 나방 갤러리아 mellonella의 애벌레는 이러한 포도상 구균, 프로테우스의 vulgaris와 같은 포유류의 곰팡이 (Fusarium oxysporum, 누룩 곰팡이 fumigatus, 칸디다 알비 칸스) 및 세균성 병원체를 포함한 미생물 감염, 다양한 범위의 pathogenesis에 유용한 통찰력을 제공하기 위해 표시되었습니다 , Serratia marcescens 모나스 aeruginosa, 리스테리아 monocytogenes 또는 Enterococcus faecalis ^4-7. 상관없이 박테리아 종, 결과는 큐티클을 통해 직접 분사에 감염 갤러리아 애벌레와 함께 지속적으로 시미의 그것과 상관 관계를 획득고맙다 포유류 연구 : 포유류의 모델 감쇠 아르 박테리아 변종은 갤러리아에서 낮은 독성을 보여줍니다, 그리고 심각한 인간 감염을 일으키는 변종도 갤러리아 모델 ^8-11에 매우 유독합니다. 갤러리아의 구강 감염이, 특정 독소와 같은 훨씬 덜 사용 및 화합물 추가됩니다는 사망률에 도달 할 필요합니다.

G. mellonella의 애벌레 존재하는 몇 가지 기술적 인 장점 : 사람들이 따라서 박테리아의 정의 복용의 주입을 사용 (pupation 전에 마지막 instar의 애벌레는 약 2 cm 길이, 무게 250 밀리그램입니다) 비교적 크기, 그들은 20 일 (다양한 온도에서 키운 할 수 있습니다 ° 30 ° C로 C) 및 감염 연구는 포유류의 환경을 모방 실험을 허용, 37 ° C ^12,13 위를 15 ° C 사이에 실시 할 수 있습니다. 또한, 곤충 양육은 쉽고 상대적으로 저렴합니다. 애벌레의 감염은 여러 수단, includin에 의해 박테리아 독성을 모니터링 할 수 있습니다LD ₅₀ ¹⁴ g 계산, 박테리아 생존 ^15,16 및 감염 과정 ¹⁷ 시험의 측정. 여기, 우리는 G.의 모든 삶의 단계를 덮고, 곤충의 양육을 설명 mellonella. 구두 및 내부 haemocoelic : 우리는 접종의 두 경로로 감염에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에 사용되는 세균 모델은 바실루스 세레 우스, 위장뿐만 아니라 다른 심각한 지역 또는 조직 기회 감염 ^18,19에 연루 그램 긍정적 인 병원체이다.

프로토콜

1. 곤충 양육

계란의 마지막 instar의 애벌레에 대한 모든 과정이 25 ° C.에 약 5 주 정도 1 개 또는 2 개 추가 주는 성인 나비를 얻기 위해 필요합니다.

1. 최소 100 pupae 또는 새로 합병 성인 G.를 배치 5 리터 와이어 메쉬 케이지의 mellonella 나비. 남자 나비는 10~15mm을 측정합니다. 성인 남성이 나방은 희미한 빛과 어두운 표시가있는 베이지 색입니다. 20mm 주변의 여성 나비 측정. 암컷은 갈색 / 회색과 수컷보다 어두운입니다.
2. 계란 부설에 대한 우리에 네 계층 종이 두 팩을 일시 중지합니다. 이일 후, 성인 여성은 신문 사이의 가장자리에 알을 낳는 것입니다.
3. 일주일에 두 번, 꽃가루와 벌 왁스가 포함 된 공기가 순환하게하기 위해 격자로 새로운 플라스틱 양육 상자에 계란 종이 팩을 넣습니다. 알은 약 3 일 부화 작은 애벌레는 왁스와 화분에 공급하여 개발 시작합니다. 또한, 애벌레는 인공 다이어트 consistin에 배치 할 수 있습니다500g 액체 꿀, 400g의 글리세린, 100g 건조 맥주 효모, 250g의 밀가루, 200g 탈지 분유와 400g 폴렌타 죽의 혼합의 g. 유충 당 음식의 적절한 비율을 제공하기 위해 정기적으로 새로운 상자에 애벌레를 분리 모든 이틀 음식을 보충.
4. 애벌레는 유충 경기장의 여섯 단계에서 키운 있습니다. 각 경기장은 유충의 머리 캡슐의 미끄럼이 특징입니다. 애벌레는 pupation 전에 마지막 단계에 도달하면, 그들은 먹이를 중지하고 가벼운 실크 누에 고치를 구축 시작합니다.
5. 자신의 보호 고치에서 애벌레 휴식하고 pupae로 변환 할 수 있습니다. 왁스 웜은 성인 나방에 등장하는 1~2주의 번데기 단계에 남아 있습니다. 성인 나방은 술도 먹지 않습니다. 짝짓기가 발생하고 왁스 웜 '수명주기가 다시 시작됩니다.
6. 병리 검정을 표준화하기 위해 마지막 애벌레의 단계에서 유충을. 이 단계에서 사람들이 먹이를 중지, 양육 상자의 덮개에 이동 실크를 생산하기 시작합니다. 이 Stage 5 일 주위 지속됩니다.

2. 감염에 대한 곤충 선택

1. 감염 전에 마지막으로 instar 무게에 2-3cm 길이 180-250 밀리그램 아르 애벌레,, 24 시간을 선택하고을 굶어 빈 상자에 넣어 두 었어요.
2. 애벌레 주변의 초기 실크 누에 고치를 제거합니다.

3. 세균 준비

1. CFU / ML 1x10 ⁸ CFU / 섭취에 대한 ML을 (CFU는 구하는 방법 10 ⁴ 식민지 성형 단위 (CFU) / ML에서 10 ⁸ CFU / 내부 haemocoelic 분사에 대한 ML과 3x10 ^{6에서까지} 최종 농도를 얻기 위해 세균 세균 현탁액을 준비 LD ₅₀₎ 박테리아 종에 따라 달라집니다. 우리의 경우, B.에 세레 우스는 Luria-Bertani 국물 매체에서 재배됩니다 (LB, 10g / L tryptone, 5g / L 효모 추출물, 10g / L NaCl) 37의 ° C 교반 이하까지 성장의 안으로 굽음에 해당하는 고정 단계로 진입, 곡선. OD 600 nm의를 (측정B. 1 사이 2 세레 우스)과 이전에 한 적정 곡선을 사용하여 세균 농도를 평가하는 데 사용합니다. 객실 온도와 인산의 resuspend 10 분 5,000 XG에서 원심 분리하여 수확 박테리아 (: 1M KH ₂ PO _4, 100 K ₂ HPO _4, 5M NaCl, pH를 7.2 PBS) 식염 버퍼링. 각 유충 원하는 농도에서 세균 현탁액의 10 μl를 받게 될 것입니다.
2. 또한, 포자 현탁액은 감염을 준비 할 수 있습니다. sporulation 매체 HCT (5 G / L tryptone, 2 G / L 카세인 가수 분해물, 12.5 MM K ₂ HPO _4, 12.5 MM MgSO _4, 0.05 MM MnSO _4, 1.2 MM ZnSO _4, 1.2 MM 철의 배양 세균을하여 포자를 얻을 ² (SO ₄₎ ^3, 0.5 % H ₂ 3 일 30 ° C 25 MM CaCl ₂₎ ^20, ₄ SO. 수확 원심 분리하여 포자 (10,000 XG, 15 분) 및 멸균 증류수에 두 번 씻는다. 포자 펠를 Resuspend남은 식물 세균을 제거하는 78시 15 분 ° C에 멸균 증류수와 열에 표시 할 수 있습니다. LB 한천 플레이트에 시리얼 dilutions을 도금하여 정지 수계. 각 유충 원하는 농도에 포자 현탁액의 10 μl를 받게 될 것입니다.

4. 독소 준비 눈물

1. B.에서 Cry1C 독소를 준비 thuringiensis 변형 407은 유전자 인코딩 Cry1C를 들고 플라스미드 pHTF31C ²¹ 변환. 30 100 ML의 HCT 매체의 문화 변형 °와 72 시간을위한 C 전체 sporulation, 문화 표면에 뜨는에 독소 크리스탈 생산과 해방을 허용하도록 (에리스로 마이신 10mg/ml) 항생제.
2. 72% -79 %의 자당 기울기에 표면에 뜨는에서 결정을 정화. 먼저 40 ML 튜브에 79 % 자당 17 ML를 추가합니다. 79 % 자당 위에 72%의 자당의주의 층 17 ML. 마지막으로, 레이어 5-6 10X 집중 sporulated 문화의 ML하고 관을 닫습니다. 20,00에서 14 시간 동안 튜브를 원심 분리기0 XG, 4 ° C는 포자의 결정을 분리합니다. 기울기 인터페이스에서 결정을 수집합니다. 그것을 씻어 25 ML 차가운 멸균 물에 크리스탈 펠렛을 Resuspend. 20 분에 8,000 XG에 원심 분리기. 이 단계는 결정에 집어 넣는 모든 자당을 제거하려면 세 번 반복됩니다. 5 ML 멸균 물에 결정을 Resuspend하고 순결을 평가하기 위해 현미경으로 관찰한다.
3. 50 MM NaOH에 presolubilized 크리스탈 솔루션에 고전 브래드 포드 착색에 의해 독소 단백질 농도를 평가합니다. 독소 결정은 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

5. 주입기 준비

1. 정확한 주입 볼륨을 제어하려면, 1 μl / 초 (그림 1A)에 설치 속도로 자동 주사기 펌프 (예 : KD 과학 KDS 100)을 사용합니다.
2. 300 μl 물 1 ML의 피하 주사기 또는 20-25 애벌레의 감염 세균 솔루션 (조건 당 1 주사기)를 입력합니다. 조심스럽게 타하여 거품을 제거주사기 pping 다음 주사기에 0.45 X 12mm 바늘을 첨부합니다.
3. 주입기에 주사기를 삽입합니다.
4. 주입 된 볼륨을 제어 할 빈 튜브에 10 μl의 빈 주사를 수행합니다.

6. 곤충 Intrahaemocoelic 사출

1. 엄지와 집게 손가락 사이에 수동으로 곤충를 놓습니다. 그런 다음 유충 피부 (표피) (그림 1C)에 분사기에서 해결 된 바늘을 삽입합니다.
2. 10 μl 세균 솔루션을 (포자 또는 식물 박테리아) 주입하면서 장소에서 곤충세요.
3. 조심스럽게 바늘에서 곤충을 제거합니다.
4. 작은 페트리 접시 (직경 5cm), 음식 당 5 유충에 감염된 곤충를 놓습니다.
5. 각 실험 조건에 대한 최소한 20 애벌레를 감염.
6. 48 시간에 대한 보육에서 37 ° C에서 요리를 놓으십시오.

7. 곤충 강제 수유 (섭취)

1. 2 ML Eppendorf 튜브에 0.2 μg / & m를 섞어U; 중 포자 나 식물 세포 현탁액과 Cry1C 독소 내가 3x10 ^4에서 10 μl 당 1x10 ^7에 이르기까지 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
2. 20-25 애벌레의 감염 세균 - Cry1C 독소 솔루션 300 μl과 30g의 25 밀리미터의 피하 주사기 바늘을 1 ML의 주사기를 채우십시오. 주사기에서 거품을 제거합니다.
3. 수동 그래서 그 입을 바늘 (그림 1D) 분사기에서 해결하고, 자동화 된 주사기 펌프를 사용하여 세균 솔루션의 10 μl로 강제 먹이를 입력하는 곤충를 놓습니다.
4. 각 실험 조건에 대한 최소한 20 애벌레를 감염.
5. 작은 5cm 페트리 접시 (접시 당 5 유충)에 감염된 곤충를 놓습니다. 48 시간에 대한 보육에서 37 ° C에서 요리를 놓으십시오.

8. 녹화 곤충 사망률

1. 힘 수유 또는 주입 실험을 한 후, 25에서 음식없이 배양 접시에있는 애벌레를 유지 ° C 또는 37 ° C. 애벌레의 몰리브덴을 확인48 시간 기간 동안 정기적으로 rtality. 죽은 유충은 불활성이며 일반적으로 검은 색을 (그림 1B) 설정합니다.
2. 사망률 데이터는 로그 Probit 프로그램 ^14을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 이 프로그램은 선량 사망률 곡선의 선형성을 시험하고 치명적인 복용 (LD _50)을 제공합니다. 또한, 이러한 프리즘 (그래프 패드), 생존을 분석하거나 사망률 데이터 같은 다른 프로그램이 사용할 수 있습니다.

결과

G.에 박테리아의 내부 haemocoelic 주입 mellonella는 여러 사람이 병원균의 타고난 면역 요인에 조직 손상 및 저항을 다루는 많은 독성 요소의 식별을 위해 매우 유용한 입증되었습니다. 예를 들어, 그림 2A는 B.의 다양한 복용의 주입 후 곤충 사망률을 나타냅니다 세레 우스 균 (야생 유형과 돌연변이 변종) ^22. 그림 2B는 G 감염 후 세균 ?...

토론

곤충, 특히 애벌레의 단계의 사용은 여러 병원체에 대한 감염 모델로, 잦은되고 있습니다. 일부 측면에 대한 선택의 모델은 성인과 애벌레의 무대 ^1,2 모두로 사용 Drosophila (플라이 모델)입니다. lepidopteran 곤충 G. mellonella는 주로 주입하여 세균 독성을 시금에 사용되었습니다. 포유류의 병원체가 공부 할 때 Drosophila보다 높은 온도를 (37 ° C 이상) (최대 25 ° C) 참아의 장점...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
왁스와 화분	라 루슈 Roanaise	303000	모든 벌꿀 생산
자동 주사기 펌프	KD 과학	KDS 100
주사 한 ML	Terumo	BS 01T
니들 0.45 X 12mm	Terumo	NN 2613R
페트리 접시 5cm	VWR	89000-300
바늘 30g의, 25 밀리미터 피하	Burkard 제조 (주)	PDE0005