L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

Riepilogo

Orale e infezioni intra haemocolic di larve della tarma della cera maggiore Galleria mellonella È descritto. Questo insetto possono essere utilizzati per studiare i fattori di virulenza di entomopatogeno nonché mammiferi batteri opportunisti. Allevamento degli insetti, i metodi di infezione ed esempi di In vivo L'analisi sono descritti.

Abstract

Lo studio della virulenza batterica richiede spesso un modello animale adatto. Modelli mammiferi di infezione sono molto costosi e possono sollevare questioni etiche. L'uso di insetti come modelli di infezione fornisce una valida alternativa. Rispetto ad altri non vertebrati host modello come nematodi, insetti hanno un sistema relativamente avanzato di difesa antimicrobici e sono quindi più in grado di produrre informazioni rilevanti per il processo di infezione dei mammiferi. Come mammiferi, insetti possiedono un complesso sistema immunitario innato ^1. Le cellule della emolinfa sono in grado di phagocytosing o riassume invasori microbici, e le risposte umorali includono la produzione di peptidi antibatterici inducibile lisozima e piccole ^2,3. Inoltre, si riscontrano analogie tra le cellule epiteliali di insetto midguts larvali e cellule intestinali dei sistemi digestivi mammiferi. Infine, alcuni componenti di base essenziali per il processo di infezione batterica, come adesione cellulare, resistenzapeptidi antimicrobici, il degrado dei tessuti e l'adattamento allo stress ossidativo sono suscettibili di essere importante in entrambi i insetti e mammiferi ^1. Così, gli insetti sono strumenti polivalenti per l'identificazione e la caratterizzazione di fattori di virulenza microbici coinvolti nelle infezioni mammiferi.

Larve di falena maggiore della cera Galleria mellonella hanno dimostrato di fornire una visione utile nella patogenesi di una vasta gamma di infezioni fungine microbiche inclusi mammiferi (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) e batteri patogeni, quali Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris , Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes o Enterococcus faecalis ^4-7. Indipendentemente dalla specie batteriche, i risultati ottenuti con larve Galleria infettato da iniezione diretta attraverso la cuticola costantemente correlate con quelle di similar studi mammiferi: ceppi batterici che sono attenuati nei modelli mammiferi dimostrano minore virulenza in Galleria, e le tensioni che causano gravi infezioni umane sono altamente virulenti nel modello Galleria ^8-11. Infezione orale della Galleria è molto meno usato e ulteriori composti, come le tossine specifiche, sono necessari per raggiungere la mortalità.

G. mellonella larve presentano diversi vantaggi tecnici: sono relativamente grandi (ultima larve instar prima pupation sono circa 2 cm e peso 250 mg), consentendo così l'iniezione di dosi prestabilite di batteri, possono essere allevati a diverse temperature (20 ° studi C a 30 ° C) e l'infezione può essere condotta tra 15 ° C al di sopra di 37 ° C ^12,13, consentendo esperimenti che simulano un ambiente di mammifero. Inoltre, l'allevamento degli insetti è facile e relativamente a buon mercato. L'infezione delle larve permette di monitorare virulenza batterica in vari modi, sapcalcolo g di LD ₅₀ ^14, la misura di sopravvivenza batterica ^15,16 e l'esame del processo di infezione ^17. Qui, descriviamo l'allevamento degli insetti, che copre tutte le fasi della vita di G. mellonella. Forniamo un dettagliato protocollo di infezione da due vie di inoculazione: haemocoelic orale e intra. Il modello batterica utilizzato in questo protocollo è Bacillus cereus, un patogeno Gram positivi implicati in gastrointestinale e in altre gravi infezioni locali o sistemiche opportunistiche ^18,19.

Protocollo

1. Allevamento insetti

L'intero ciclo da uovo all'ultimo larve instar dura circa 5 settimane a 25 ° C. Uno o 2 settimane supplementari sono necessari per ottenere farfalle adulte.

1. Inserire almeno 100 pupe o di nuova fusione adulto G. farfalle mellonella in un 5 litri maglia metallica gabbia. Farfalle maschio misurare 10 a 15 mm. La falena maschio adulto è beige con la luce debole e macchie scure. Donna misura farfalle di circa 20 mm. Le femmine sono più scure dei maschi con un marrone / grigio.
2. Sospendere due pacchetti di quattro strati di carta nella gabbia per la deposizione delle uova. Dopo 2 giorni, la femmina adulta si depongono le uova sul bordo tra le carte.
3. Due volte a settimana, posizionare le uova di carta confezioni in nuove scatole di allevamento di plastica con griglie per permettere all'aria di circolare, contenente polline e cera d'api. Le uova si schiudono in circa 3 giorni e piccole larve iniziano a sviluppare nutrendosi di cera e polline. In alternativa, le larve possono essere posizionati su una dieta artificiale consisting di una miscela di 500 g di miele liquido, glicerina 400 g, 100 g di lievito di birra essiccato, farina di frumento 250 g, 200 g di latte scremato in polvere e 400 g polenta. Per fornire il rapporto adeguato di cibo per larva, regolarmente separare le larve in scatole nuove e riempire il cibo ogni due giorni.
4. Le larve sono allevati durante le sei fasi dello stadio larva. Ogni stadio è caratterizzato dalla slittamento della capsula testa di larve. Quando le larve raggiungono l'ultima tappa prima impupamento, smettono di alimentazione e iniziare a costruire un bozzolo di seta leggera.
5. Nelle loro bozzoli protettivi, le larve si riposerà e si trasformano in pupe. Vermi di cera rimangono in fase di pupa per una o due settimane per emergere in falene adulte. Le falene adulte non bere né mangiare. L'accoppiamento avviene e il ciclo di vita dei vermi di cera 'ricomincia.
6. Per uniformare il saggio patologia, prendere le larve durante l'ultimo stadio larvale. Durante questa fase si fermano alimentazione, spostare il coperchio della scatola di allevamento e iniziare a produrre la seta. Questo stage dura circa 5 giorni.

2. Selezione insetti per l'infezione

1. Selezionare ultimo larve instar, che sono 2-3 cm di lunghezza e 180-250 mg di peso, 24 ore prima di infezioni e metterle in una scatola vuota per farli morire di fame.
2. Rimuovere il bozzolo di seta attorno al nascente larve.

3. Preparazione batterica

1. Preparare sospensioni batteriche Bacillus per ottenere concentrazioni finali che vanno da 10 ⁴ unità formanti colonie (ufc) / ml a 10 ⁸ cfu / ml per iniezione intra haemocoelic e da 3x10 ⁶ cfu / ml a 1x10 ⁸ cfu / ml per ingestione (la ufc per ottenere un LD ₅₀ dipende dalla specie batterica). Nel nostro caso, B. cereus è coltivato in Luria-Bertani brodo (LB, 10 g / l triptone, 5 g / l di estratto di lievito, 10 g / l NaCl) a 37 ° C sotto agitazione fino all'entrata in fase stazionaria, corrispondente alla incurvation della crescita curva. Misurare le OD (600 nmtra 1 e 2 di B. cereus) e usarlo per valutare la concentrazione batterica, utilizzando una curva di titolazione precedentemente fatto. Batteri raccolto per centrifugazione a 5000 xg per 10 min a temperatura ambiente e risospendere in tampone fosfato isotonico (PBS: 1M KH ₂ PO _4, 1M K ₂ HPO _4, 5M NaCl, pH 7,2). Ogni larva riceverà 10 ml di sospensione batterica alla concentrazione desiderata.
2. In alternativa, sospensione di spore può essere preparato per l'infezione. Ottenere spore coltivando i batteri nella sporulazione mezzo HCT (5 g / L triptone, 2 g / L caseina idrolizzato, 12,5 mm K ₂ HPO _4, 12.5 mM _MgSO4, 0.05 mM MnSO _4, 1,2 mm ZnSO _4, 1.2 mM Fe ² (SO ₄₎ ^3, 0,5% H ₂ SO _4, 25 mM CaCl ₂₎ ²⁰ a 30 ° C per 3 giorni. Harvest spore mediante centrifugazione (10.000 xg, 15 min), e lavare due volte in acqua distillata sterile. Risospendere il pel sporelasciate in acqua distillata sterile e calore per 15 min a 78 ° C per rimuovere residui batteri vegetativi. Numerare la sospensione da placcatura diluizioni seriali su piastre di agar LB. Ogni larva riceverà 10 pl di sospensione di spore alla concentrazione desiderata.

4. Cry Preparazione Tossina

1. Preparare la tossina Cry1C dal B. ceppo thuringiensis 407 trasformato con il plasmide pHTF31C ²¹ portando la Cry1C gene codificante. Coltura del ceppo in mezzo HCT 100 ml a 30 ° C per 72 ore con antibiotici (eritromicina 10mg/ml) per consentire sporulazione completa, cristallo produzione della tossina e liberazione nel supernatante di coltura.
2. Purificare cristalli dal supernatante su un gradiente di saccarosio 72% -79%. Prima aggiungere 17 ml di 79% saccarosio in una provetta 40 ml. Attentamente strato 17 ml di saccarosio 72% sopra il 79% di saccarosio. Infine, strato 5-6 ml della coltura concentrato 10X sporigeni e chiudere il tubo. Centrifugare la provetta per 14 ore a 20,000 xg, a 4 ° C, per separare i cristalli dalle spore. Raccogliere i cristalli all'interfaccia gradiente. Risospendere il pellet di cristallo in 25 ml di acqua fredda sterile per lavarlo. Centrifugare a 8000 xg per 20 min. Questo passaggio viene ripetuto tre volte per rimuovere tutti saccarosio aderiscano alle cristalli. Risospendere i cristalli in 5 ml di acqua sterile ed osservare al microscopio per valutare la purezza.
3. Valutare la concentrazione di proteine ​​tossina mediante colorazione classica Bradford sulla soluzione a cristalli presolubilized in 50 mM NaOH. Cristalli tossina può essere conservato a -20 ° C fino all'uso.

5. Iniettore Preparazione

1. Per controllare il volume esatto di iniezione, utilizzare una pompa automatizzato siringa (es Scientific KDS KD 100) con velocità di installazione a 1 ml / sec (Figura 1A).
2. Riempire una siringa da 1 ml ipodermica con 300 microlitri di acqua o la soluzione batterica (1 siringa per condizione) per l'infezione di 20-25 larve. Rimuovere le bolle con cura tapping la siringa, quindi fissare un x 0.45 12 ferri alla siringa.
3. Posizionare la siringa nell'iniettore.
4. Effettuare un'iniezione vuoto di 10 microlitri in un tubo vuoto per controllare il volume iniettato.

6. Insetto iniezione Intrahaemocoelic

1. Posizionare l'insetto manualmente tra il pollice e l'indice. Quindi inserire l'ago fissato l'iniettore nella pelle larva (cuticola) (Figura 1C).
2. Tenere l'insetto in posizione durante l'iniezione di 10 ul di soluzione batterica (batteri spore o vegetativa).
3. Rimuovere con cautela l'insetto dall'ago.
4. Posizionare l'insetto infetto in una piccola scatola di Petri (5 cm di diametro), 5 larve per piatto.
5. Infect almeno 20 larve per ogni condizione sperimentale.
6. Porre le capsule a 37 ° C in un incubatore per 48 ore.

7. Forza alimentazione degli insetti (Ingestione)

1. In una provetta Eppendorf da 2 ml, miscelare 0,2 mg / m &u; l di tossina Cry1C sia con sospensione cellulare spore o vegetativa ottenere concentrazioni finali che vanno da 3x10 a 1x10 ^{4 7} per 10 pl.
2. Riempire una siringa da 1 ml con una 30G, 25 ago ipodermico mm con 300 microlitri della soluzione batterica-Cry1C tossina per l'infezione di 20-25 larve. Rimuovere le bolle dalla siringa.
3. Posizionare l'insetto manualmente in modo che la sua bocca entra l'ago fissato l'iniettore (Figura 1D), e forzarlo a mangiare con 10 pl della soluzione batterica utilizzando la pompa automatizzato siringa.
4. Infect almeno 20 larve per ogni condizione sperimentale.
5. Posizionare l'insetto infetto in un piccolo 5 centimetri Petri (5 larve per piatto). Porre le capsule a 37 ° C in un incubatore per 48 ore.

8. Registrazione Insetto Mortalità

1. Dopo gli esperimenti di ingozzatura o iniezione, mantenere le larve nella scatola di Petri senza cibo a 25 ° C o 37 ° C. Controllare larvale mortality regolarmente per un periodo di 48 ore. Larve morte sono inerti e di solito diventa nero (Figura 1B).
2. I dati di mortalità possono essere analizzati utilizzando il log-probit programma ^14. Questo programma collauda la linearità delle curve di mortalità dose e fornisce dosi letali (LD _50). In alternativa, altri programmi, come Prism (grafico Pad), analizzando la sopravvivenza o dati di mortalità possono essere utilizzati.

Risultati

Intra haemocoelic iniezione di batteri in G. mellonella è stato dimostrato molto utile per l'identificazione di fattori di virulenza molti occupano di danno tissutale e resistenza a fattori immuni innate di diversi agenti patogeni umani. Come esempio, la figura 2A rappresenta la mortalità insetto dopo iniezione di varie dosi di B. batteri cereus (wild type e mutanti) ^22. figura 2B rappresenta la sopravvivenza dopo l'infezione batterica di ...

Discussione

L'uso di insetti e in particolare la fase larvale, come modelli di infezione per i patogeni più, sta diventando frequente. Un modello di scelta per alcuni aspetti è Drosophila (il modello di volo) utilizzato come adulti e ^1,2 stadio larvale. L'insetto lepidotteri G. mellonella stato anche utilizzato principalmente per saggiare la virulenza batterica per iniezione. Il vantaggio di tollerare temperature più elevate (oltre i 37 ° C) rispetto Drosophila (massimo 25 ° C) è ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Cera e polline	La Ruche Roanaise	303000	Ogni produttore di miele
Siringa pompa automatica	KD scientifico	KDS 100
Siringa da 1 ml	Terumo	BS 01T
Ago 0,45 x 12 mm	Terumo	NN 2613R
Petri 5 centimetri	VWR	89000-300
Ago 30G, 25 millimetri ipodermico	Burkard Mfg. Co. Ltd.	PDE0005