JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذه المقالة طريقة لتصور الشرايين الدماغية الفئران من خلال نافذة الجمجمة باستخدام قطع القحف الزمنية لعرض أجزاء القريبة من الشريان الدماغي الأوسط ( الشكل 1). ويمكن الجمع بين هذه الطريقة تنوعا مع تقنيات مختلفة لاستخدام العقاقير لقياس التفاعل الدماغي الشريان في الجسم الحي.

Abstract

إنشاء نافذة الجمجمة هو الأسلوب الذي يسمح التصور المباشر الهياكل على سطح القشرية من الدماغ 1-3. لا يمكن أن يؤديها هذه التقنية في العديد من المواقع التي تغمر المخ الفئران، ولكن هو الأكثر بسهولة نفذت من خلال خلق قطع القحف على العظام يمكن الوصول إليها بسهولة أو الجبهي الجداري. في معظم الأحيان، وقد استخدمنا هذه التقنية بالاشتراك مع endothelin-1 الشريان المخي الأوسط نموذج انسداد السكتة الدماغية لتحديد التغيرات في الشريان المخي الأوسط قطر السفينة التي تحدث مع الحقن من 1-endothelin في لحمة الدماغ المتاخمة للMCA القريبة 4، 5. من أجل تصور الجزء القريب من خلال MCA يسببها endothelin MCAO -1، نستخدم تقنية لإنشاء إطار الجمجمة عن طريق العظم الصدغي على الجانب الوحشي من الجمجمة الفئران (الشكل 1). يمكن تصور الشرايين الدماغية إما مع أو الجافية سليمة مع قطعي الجافية وretraالمديرية. الأكثر شيوعا، نترك سليمة الجافية خلال التصور منذ endothelin-1 MCAO بفعل ينطوي على تسليم الببتيد vasoconstricting في لحمة الدماغ. هذا يتجاوز الحاجة إلى شق الجافية مباشرة عبر السفن تصور لتسليم المخدرات. وهذا البروتوكول تصف كيفية إنشاء إطار لتصور الشرايين القحفية الدماغية على نحو تدريجي، وكذلك كيفية تجنب الكثير من المزالق المحتملة المتصلة بهذا الأسلوب.

Protocol

وقد وافق هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية فلوريدا ومتوافق مع "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (الطبعة الثامنة، والأكاديمية الوطنية للعلوم، 2011).

المواد

  1. الحيوانات: ثمانية أسابيع من العمر، من الذكور، سبراغ داولي الفئران (تشارلز ريفر مزارع، ويلمنجتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) وزنها 250-300 ز في وقت الجراحة.
  2. خدر
    1. استنشاق التخدير نظام (VetEquip شركة، بليسانتون، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. Isoflurane مخدر (الصيدلانيات باكستر، ديرفيلد، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
  3. التجسيمي النظام (ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    1. نظام الحيوانات الصغيرة التجسيمي
    2. غير تمزق الأذن القضبان لالفئران
    3. حامل الغاز رئيس التخدير بالنسبة للفئران
  4. درجة الحرارة التنظيم
    1. BAT-12 ميزان حرارة المسبار الميكروي (البنكأدوات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. T / PUMP، TP600 بطانية الحرارية (صناعات Gaymar، وشركة، بستان حديقة، NY، USA)
  5. الأدوات الجراحية
    1. Metzenbaum مقص، ملقط القزحية، الكامشات المشبك البلدغ، 10 ميكرولتر مع حقنة إبرة قياس 26 مشطوف، Bovie الكي عدة (البنك أدوات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. محرك صغروي الحفر (Stoelting، الخشب دايل، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. 0،8 مم بر حفر الجولة (Roboz الجراحية الصك المحدودة، وشركة، غايثرسبيرغ، MD، الولايات المتحدة الأمريكية)
    4. STORZ بون خياطة الملقط (باوش ومب و، وشركة، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية)
  6. اللوازم الجراحية
    1. 3،0 النايلون خياطة (الواحة، Mettawa، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. مسحات القطن، Puralube مرهم العين (فيشر العلمية، بتسبرغ، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    3. نقاط جراحية وشرائح (مدترونيك Xomed، وشركة، جاكسونفيل، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
    4. كليبرز الشعر الكهربائية (اوستر، بروفيدانس، رود آيلند، الولايات المتحدة الأمريكية)
  7. المواد الكيميائية
    1. Endothelin-1 (الأمريكية الببتيد، سانيفيل، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. الكلورهيكسيدين 2٪ (Agrilabs، وسانت جوزيف، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
  8. التصور معدات
    1. المجهر الجراحي (SEILER الصك وتصنيع؛ سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
    2. سوني هاندي كام HDR-SR12 (سوني، ميناتو، طوكيو، اليابان)
    3. إضاءة الألياف البصرية (TechniQuip شركة، ليفرمور، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
  9. قياس قطر السفينة
    1. VLC وسائل الاعلام لاعب (باريس، فرنسا)
    2. الصورة J البرمجيات (يماغيج 1.42q البرامج والمعاهد الامريكية الوطنية للصحة في بيثيسدا، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)

1. خطوات ما قبل الجراحة

  1. قبل الجراحة، ويعيش الفئران تحت دائرة الضوء / الظلام 12:12 مع حرية الوصول إلى المياه والقوارض تشاو.
  2. هو فعل التخدير مع 4٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2 في دائرة التعريفي.
  3. الغراب وحلق الرأس ن مع كليبرز الشعر الكهربائية.
  4. يتم وضع الفئران في وضعية الرقود على وسادة ماصة الكذب على سطح التشغيل التحكم في درجة حرارته (بطانية الحرارية) ويتم وضع الرأس في جهاز التجسيمي بدءا من وضع قناع الوجه الغاز مخدر.
  5. المقبل، يتم إدراج أشرطة الأذن وشددت.
  6. خلال إجراء التخدير يتم الاحتفاظ بنسبة 2٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2.
  7. يتم تطبيق مرهم البصريات مواد التشحيم لكلتا العينين، والجفون مغلقة لمنع جفاف العين خلال العملية الجراحية.
  8. يتم إدراج التحقيق درجة حرارة الجسم الأساسية للحفاظ على درجة حرارة ثابتة الحيوانية من 37 ± 0.5 ° C.
  9. مع رئيس الفئران تخدير عقد بحزم في الجهاز التجسيمي منطقة العمليات الجراحية هو تطهير بالتناوب مع الكلورهيكسيدين والمالحة ثلاث مرات.

2. قبل الجمجمة نافذة إعداد

ontent "> قبل إنشاء نافذة الجمجمة، ينبغي إعداد الفئران عن أي تجارب من قبل غرس الأجهزة الأخرى المطلوبة ويجب أن يحصل أي إجراءات المطلوبة الجراحية. لهذا البروتوكول، لقد زرع في السابق قنية دليل لل1-endothelin (ET- 1) الناجم عن MCAO كما هو مبين في منشور بعنوان رفيق "Endothelin-1 المستحثة انسداد الشريان الدماغي الأوسط نموذج للالسكتة الدماغية مع التوجيه بالليزر Flowmetry دوبلر في الفئران."

3. إنشاء نافذة القحف

بعد وضع قنية دليل أو المعدات اللازمة لإجراء التجارب، وإنشاء إطار لتصور الجمجمة مباشرة القريب من أجزاء الشريان الدماغي الأوسط خلال إجراء السكتة الدماغية.

  1. أولا، يتم استخدام مقص لشق الجلد المغطي العضلات الصدغي بدءا إعلامي والعمل أفقيا.
  2. هو شطر العضلة الصدغية باستخدام كاو كهربي ثم تراجع استخدام النايلون لخياطة 3،0 visua ليز الجزء الحرشفية من العظم الصدغي.
  3. ويوجه ساحة حوالي 3-4 ملم على الجزء الحرشفية من العظم الصدغي الذيلية إلى المدار ومتفوقة على قاعدة من عملية الوجني كما أنه يعكس الخروج من العظم الصدغي.
  4. يتم استخدام الحفر لخفض تدريجيا قطعة المحددة من العظام خالية من العظم الصدغي. وينبغي الحرص على تجنب تطبيق الكثير من الضغط على الحفر لأنه من الممكن أن تضر أو ​​قشرة الدماغ الجافية.
  5. يتم تنفيذ يشطف متكررة مع ملحي معقم لتحسين التصور من مجال الجراحة ومنع ارتفاع درجة حرارة الجمجمة.
  6. بدءا من الزاوية الحرة، تتم إزالة بعناية قطعة من العظام باستخدام temoporal غرامة ملقط ذو أسنان الفئران في حين التأكد من عدم المسيل للدموع أي سفن المرتبطة الجافية.
  7. يتم ترك الجافية سليمة ويتم شطف بعيدا الحطام باستخدام ملحي معقم.

4. تسجيل انقباض الشريان الدماغي

يستخدم خيمة "> لشرح كيفية التقاط الصور في الوقت الحقيقي، والفئران التي تمر ET-1 يسببها MCAO لهذا البروتوكول.

  1. قبل تطبيق مركبات فعال في الأوعية، يجب تسجيل الفيديو الأساسية لما لا يقل عن 1 دقيقة. لET-1 MCAO يسببها، يتم تسجيل خط الأساس بمجرد خفض الإبرة في المخ ولكن لحمة قبل الحقن ET-1.
  2. بدء تشغيل مضخة للحقن حقنة وسجلت لمدة 1 ساعة أو حتى نقطة النهاية المرجوة. تبقى الإبرة في مكانها أثناء تسجيل الفيديو من أجل منع الاضطرابات من المستوى البؤري.
  3. يجب أن يكون الفأر تخدير عميق والموت الرحيم وفقا لبروتوكول افق بعد هذا الإجراء.

5. تحليل الصور

يمكن تحديد القطر السفينة عن أي جزء من تصور MCA. وكمثال على ذلك، سوف نستخدم فرع واحد من MCA لقياس قطر السفينة على نقطة في الوقت قبل وبعد حقن ET-1. الأمراض المنقولة جنسيايتم التقاط إطارات ليرة لبنانية من الفيديو على فترات حد أدنى 1 باستخدام VLC media player ل(VideoLAN).

  1. تم تثبيت VLC لاعب وفتح.
  2. من خلال اختيار أدوات ثم تفضيلات، يتم تغيير الإعداد إلى "جميع" تحت "إعدادات العرض."
  3. "قائمة الفيديو" يتم توسيع في شريط الجانب الأيسر و"وحدات الإخراج" ثم يتم توسيع. "فلاتر المشهد" لتحديد إظهار قائمة الفيديو مشهد التصفية.
  4. يتم كتابتها "المشهد" في خانة اسم الملف لالبادئة.
  5. يتم تعريف بادئة مسار الدليل. هذا هو المكان الذي يتم حفظ الإطارات يزال.
  6. يتم تحديد نسبة A التسجيل على أساس معدل المطلوب من إلتقاط يزال. وفي حال عدم القبض على الفيديو في 29 لقطة في الثانية، ثم "1749" (29 إطارات / ثانية × 60 ثانية / دقيقة) يمكن إدخالها في مربع لحفظ إطار واحد لا يزال كل دقيقة 1. ثم يتم حفظ جميع التغييرات.
  7. ثم يتم فتح شريط الفيديو المطلوب في مشغل VLC لانقاذ تلقائيا لا يزال الإطارات مرة كل دقيقة 1.
  8. ثم يتم قياس القطر باستخدام هذه السفينةالصور. أولا، يتم فتح برنامج يماغيج (NIH).
  9. ثم يتم فتح الأطر التي سوف تزال في قياس يماغيج.
  10. عن طريق اختيار "تحليل" القائمة، "تعيين القياسات" ثم يتم فتح جميع المربعات ودون رادع.
  11. المقبل، يتم تحديد أداة خط مستقيم.
  12. اختصار لوحة المفاتيح "السيطرة +" يستخدم لتكبير حسب الحاجة ويتم وضع خط عمودي على مسار السفينة لقياس قطر السفينة.
  13. وأخيرا، يتم الحصول على طول السفينة عن طريق اختيار "تحليل" القائمة ثم "التدبير" (CTRL + M) للحصول على طول السفينة.
  14. يتم تكرار هذه العملية على الأقل ثلاث مرات وبلغ متوسط ​​قياس لقياس كل سفينة في كل إطار يزال.
  15. وتطبيع قطر السفينة في كل نقطة من الوقت لخط الأساس قطر السفينة حتى يمكن إجراء المقارنات باستخدام الفئران متعددة. للقيام بذلك، استخدم الصيغة الحالية قطر / قطر × خط الأساس 100٪ لحساب قطر خط الأساس٪ من كل سفينة.

النتائج

صور ثابتة مأخوذة من عرض الفيديو الملتقط أن التغيير في القطر الشريان الدماغي بعد ET-1 يمكن حقن تقديره بسهولة باستخدام هذه التقنية نافذة الجمجمة (الشكل 2). في غضون دقائق من حقن ET-1، سوف تبدأ في السفينة انقباض. في نهاية المطاف سوف تكون الأوعية الصعب تصور وأنسجة الم?...

Discussion

وباختصار، هذه النافذة إعداد الجمجمة تقنية متعددة جدا ويمكن تغييره لتلبية احتياجات العديد من التجارب مع تعديلات طفيفة 4، 5. على سبيل المثال، رصد نجحنا تدفق الدم الدماغي في فروع محددة باستخدام الليزر MCA دوبلر flowmetry التركيز مباشرة على الشريان الدماغي تصور من خلال ?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من أمريكا انضم جمعية القلب جنوب شرق الكبرى (09GRNT2060421)، الجمعية الطبية الأمريكية، ومن جامعة العلوم السريرية ومعهد فلوريدا بالحركة. آدم مكة هو زميل NRSA NIH / NINDS، predoctoral (NS-F30 060335). تلقى روبرت Regenhardt predoctoral الدعم زمالة من جامعة فلوريدا برنامج التدريب المتعدد التخصصات في ارتفاع ضغط الدم (HL-T32 083810).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
استنشاق التخدير النظام VetEquip شركة، بليسانتون، CA، الولايات المتحدة الأمريكية 901806
Isoflurane مخدر الصيدلانيات باكستر، ديرفيلد، IL، USA 1001936060
نظام الحيوانات الصغيرة التجسيمي ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية 900
غير تمزق القضبان الأذن، الجرذ ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية 957
الفئران رئيس التخدير الغاز حامل ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية 1929
BAT-12 ميزان حرارة مسبار مجهري العالم آلات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية BAT-12
T / PUMP، غطاء حراري صناعات Gaymar، وشركة، بستان حديقة، NY، USA T / PUMP، TP600
Metzenbaum مقص العالم آلات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية 501254
ملقط القزحية العالم آلات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية 15915
البلدغ الكامشات المشبك العالم آلات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية 14119-G
10 حقنة ميكرولتر 26-gaugue العالم آلات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية SGE010RNS
Bovie، الكي درجة حرارة عالية طقم العالم آلات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية 500392
ملقط الأسنان الفئران 0،12 Stotz E1811
محرك صغروي الحفر Stoelting،الخشب دايل، IL، الولايات المتحدة الأمريكية 51449
0.8 مم بر حفر الجولة Roboz الجراحية الصك المحدودة، وشركة، غايثرسبيرغ، MD، الولايات المتحدة الأمريكية RS-6280C-1
STORZ بون خياطة ملقط باوش ومب و، وشركة، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية
النايلون خياطة، حجم 3،0 احة، Mettawa، IL، الولايات المتحدة الأمريكية MV-663
القطن مسحات فيشر العلمية، بتسبرغ، PA، الولايات المتحدة الأمريكية 22-029-488
Puralube العين مرهم فيشر العلمية، بتسبرغ، PA، الولايات المتحدة الأمريكية NC0138063
كليبرز الشعر الكهربائية اوستر، بروفيدانس، رود آيلند، الولايات المتحدة الأمريكية 78005-301
ET-1 مخففة إلى 80 μ M تركيز في برنامج تلفزيوني الببتيد الأمريكية، سانيفيل، CA، الولايات المتحدة الأمريكية 88-1-10A
الكلورهيكسيدين، 2٪ Agrilabs، وسانت جوزيف، MO، الولايات المتحدة الأمريكية 1040، القس 6-06، NAC رقم: 10580322
المجهر الجراحي SEILER الصك والتصنيع، وسانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية تطور xR6
سوني هاندي كام سوني، ميناتو، طوكيو، اليابان HDR-SR12
إضاءة الألياف البصرية TechniQuip شركة، ليفرمور، CA، الولايات المتحدة الأمريكية FO1-150
VLC وسائل الاعلام لاعب (باريس، فرنسا)
الصورة J البرمجيات الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MA، الولايات المتحدة الأمريكية

References

  1. Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
  2. Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
  3. Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
  4. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  5. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

72 Endothelin 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved