Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Resumen

Este artículo describe un método para la visualización de las arterias cerebrales de rata a través de una ventana craneal mediante craniectomía temporal con el fin de ver las partes proximales de la arteria cerebral media ( Figura 1). Este método versátil se puede combinar con diversas técnicas de administración de fármacos para medir la reactividad de la arteria cerebral In vivo.

Resumen

Creación de una ventana craneal es un método que permite la visualización directa de las estructuras en la superficie cortical del cerebro ^1-3. Esta técnica se puede realizar en muchas localizaciones que recubren el cerebro de rata, pero es más fácil de llevar a cabo mediante la creación de una craniectomía sobre los huesos de fácil acceso frontal o parietal. Con más frecuencia, se ha utilizado esta técnica en combinación con la endotelina-1 medio modelo oclusión de la arteria cerebral del accidente cerebrovascular isquémico para cuantificar los cambios en el diámetro medio vaso cerebral arteria que se producen con inyección de endotelina-1 en el parénquima cerebral adyacente a la MCA proximal ^{4, 5.} Con el fin de visualizar la parte proximal de la MCA durante endotelina -1 inducida MCAO, se utiliza una técnica para crear una ventana craneal a través del hueso temporal en el aspecto lateral del cráneo de rata (Figura 1). Arterias cerebrales puede ser visualizado o bien con la duramadre intacta o con la duramadre y incisa RetraDirección Ejecutiva. Por lo general, dejamos la duramadre intacta durante la visualización desde la endotelina-1 inducida por MCAO implica la entrega del péptido vasoconstrictor en el parénquima cerebral. Esto evita la necesidad de una incisión en la duramadre directamente sobre los vasos visualizado para la administración de fármacos. Este protocolo se describe cómo crear una ventana craneal para visualizar las arterias cerebrales de una forma gradual, así como la manera de evitar muchos de los problemas potenciales relacionados con este método.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Florida y está en conformidad con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (octava edición de la Academia Nacional de Ciencias, 2011).

Materiales

1. Animales: Ocho semanas de edad, macho, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, EE.UU.) con un peso de 250-300 g en el momento de la cirugía.
2. Anestesia
   1. Inhalación sistema de anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EE.UU.)
   2. El isoflurano anestesia (Farmacia Baxter, Deerfield, IL, EE.UU.)
3. Estereotáxica sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE.UU.)
   1. Animal Pequeño sistema estereotáxico
   2. Para no romper los oídos barras para ratas
   3. Anestesia Gas cabeza titular para ratas
4. Regulación de la temperatura
   1. BAT-12 termómetro microsonda (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
   2. T / PUMP, TP600 manta térmica (Industrias Gaymar, Inc., Orchard Park, Nueva York, EE.UU.)
5. Los instrumentos quirúrgicos
   1. Metzenbaum tijera iris pinzas, separadores bulldog abrazadera, jeringa de 10 ml con aguja de calibre 26 biselado, Bovie cauterización kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
   2. Micromotor de perforación (Stoelting, Wood Dale, IL, EE.UU.)
   3. 0,8 mm redondo taladro fresa (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.)
   4. STORZ Bonn sutura Pinzas (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, EE.UU.)
6. Suministros Quirúrgicos
   1. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EE.UU.)
   2. Hisopos de algodón, pomada ocular Puralube (Fisher Científico, Pittsburgh, PA, EE.UU.)
   3. Puntos quirúrgicos y tiras (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, EE.UU.)
   4. Máquinas de cortar el cabello (eléctricas Oster, Providence, Rhode Island, EE.UU.)
7. Químicos
   1. La endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EE.UU.)
   2. La clorhexidina al 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EE.UU.)
8. Visualización de equipos
   1. Microscopio quirúrgico (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, EE.UU.)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokio, Japón)
   3. Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp., Livermore, CA, EE.UU.)
9. Medición del diámetro de los vasos
   1. VLC media player (París, Francia)
   2. Image J software (software ImageJ 1.42q, EE.UU. Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MA, EE.UU.)

1. Pre-quirúrgicos Pasos

1. Antes de la cirugía, las ratas se alojaron en un 12:12 luz / oscuridad ciclo con acceso libre a comida y agua roedores.
2. La anestesia se indujo con 4% de isoflurano en 100% de mezcla de gas O ₂ en una cámara de inducción.
3. El cuervo n de la cabeza rapada con cortar el pelo eléctricas.
4. La rata se coloca en posición de decúbito prono sobre una almohadilla absorbente tendido en una superficie de operación de temperatura controlada (manta térmica) y la cabeza se coloca en el aparato estereotáctico de partida con la colocación de la máscara facial gas anestésico.
5. A continuación, las barras del oído se inserta y se aprieta.
6. Durante el procedimiento de anestesia se mantiene con 2% de isoflurano en 100% de mezcla de gas O _2.
7. Pomada oftálmica lubricante se aplica a ambos ojos y los párpados están cerrados para prevenir la desecación del ojo durante el procedimiento quirúrgico.
8. Una sonda de temperatura rectal es insertado para mantener una temperatura constante animales núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
9. Con la cabeza de la rata anestesiada mantiene firmemente en el dispositivo estereotáxico el área quirúrgica se limpia con alternancia de clorhexidina y solución salina tres veces.

2. Pre-craneal Ventana Preparación

ONTENIDO "> Antes de la creación de una ventana craneal, la rata debe estar preparado para cualquier experimento mediante la implantación de hardware requerida y debe recibir ningún procedimientos quirúrgicos requeridos. Para este protocolo, se han implantado previamente una cánula guía para la endotelina-1 (ET- 1) inducida por MCAO como se muestra en una publicación que titula "La endotelina-1 inducida cerebral media oclusión arterial Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata".

3. Creación de la ventana craneal

Después de la colocación de una cánula guía o el equipo requerido para la experimentación, una ventana craneal se crea para visualizar directamente las porciones proximales de la arteria cerebral media durante un procedimiento de accidente cerebrovascular.

1. En primer lugar, las tijeras se utilizan para incisión en la piel que recubre el músculo temporal medial de partida y trabajar lateralmente.
2. El músculo temporal es atravesada con electrocauterio y luego se retractó utilizando 3,0 sutura de nylon para visua lizar la porción escamosa del hueso temporal.
3. Un cuadrado aproximadamente 3-4 mm se dibuja sobre la porción escamosa del hueso temporal caudal a la órbita y superior a la base del proceso cigomático como se refleja fuera del hueso temporal.
4. Un taladro se utiliza para cortar gradualmente la pieza resumidas de hueso libre del hueso temporal. Se debe tener cuidado para evitar la aplicación de demasiada presión a la broca, ya que es posible dañar la dura o corteza cerebral.
5. Enjuagues frecuentes con solución salina estéril se realizan para mejorar la visualización del campo quirúrgico y evitar el sobrecalentamiento del cráneo.
6. A partir de una esquina suelta, el trozo de hueso temoporal se retira cuidadosamente con finos dientes de rata pinzas asegurándose de no romper ningún buque asociados con la duramadre.
7. La duramadre se deja intacto y escombros se enjuaga con solución salina estéril.

4. Grabación de constricción de las arterias cerebral

tienda de campaña "> Para demostrar cómo capturar imágenes en tiempo real, una rata que está pasando por ET-1 inducida por MCAO se utiliza para este protocolo.

1. Antes de la aplicación de compuestos vasoactivos, un vídeo de línea de base debe ser registrada por lo menos durante 1 min. Para ET-1 inducida por MCAO, la grabación de línea de base se realiza una vez que la aguja ha sido bajada en el parénquima cerebral, pero antes de la inyección de ET-1.
2. La bomba de jeringa se inicia por inyección y grabado durante 1 hora o hasta que el punto final deseado. La aguja se deja en su lugar durante la grabación de vídeo con el fin de evitar perturbaciones en el plano focal.
3. La rata debe ser profundamente anestesiados y sacrificados de acuerdo con un protocolo aprobado siguiendo este procedimiento.

5. Análisis de Imagen

El diámetro del vaso se puede determinar para cualquier parte de la visualizaron MCA. Como ejemplo, vamos a utilizar una rama de la MCA para medir el diámetro del vaso en los puntos de tiempo antes y después de la inyección de ET-1. Stimarcos ll del video se capturan a intervalos de 1 min utilizando VLC media player (VideoLAN).

1. VLC jugador está instalado y se abrió.
2. Mediante la selección de herramientas y luego preferencias, el ajuste cambia a "All" en "Mostrar valores".
3. El "menú de vídeo" se expande en la barra lateral izquierda y "módulos de salida" se expande entonces. "Los filtros de Escena" está seleccionado para que aparezca el menú de vídeo escena filtro.
4. "Escena" se escribe en el cuadro de nombre de archivo para el prefijo.
5. Un prefijo de ruta del directorio está definido. Aquí es donde se guardan imágenes fijas.
6. Una relación de grabación se selecciona basándose en la velocidad deseada de captura de imagen fija. Si un vídeo se capturó a 29 fotogramas por segundo, a continuación, "1749" (29 cuadros / seg x 60 seg / min) se consignarán en la casilla para guardar una imagen fija cada 1 min. Todos los cambios se guardarán.
7. El vídeo deseado se abrió en el reproductor VLC para guardar automáticamente imágenes fijas una vez cada 1 min.
8. El diámetro del vaso se mide entonces usando estosimágenes. En primer lugar, el software ImageJ (NIH) se abre.
9. A continuación, los cuadros fijos que se va a medir se abren en ImageJ.
10. Seleccionando la opción "analizar" menú ", establecer medidas" se abrió y todas las casillas estén marcadas.
11. A continuación, la herramienta de la línea recta se selecciona.
12. La combinación de teclas "Ctrl +" se utiliza para hacer un zoom según sea necesario y se coloca una línea perpendicular a la trayectoria recipiente para medir el diámetro del vaso.
13. Por último, la eslora del buque se obtiene seleccionando la opción "analizar" y haga "medida" (Ctrl + M) para obtener la eslora del buque.
14. Este proceso se repitió al menos tres veces y se promediaron para cada recipiente de medida se mide en cada trama todavía.
15. El diámetro del vaso en cada punto de tiempo se normaliza al diámetro del vaso de referencia de modo que se pueden hacer comparaciones múltiples utilizando ratas. Para ello, utilice la fórmula actual Diámetro / diámetro basal x 100% para calcular el diámetro basal% de cada buque.

Resultados

Las imágenes fijas tomadas de la serie de vídeo capturado que el cambio en el diámetro de la arteria cerebral después de la inyección de ET-1 se puede apreciar fácilmente utilizando esta técnica de ventana craneal (Figura 2). Pocos minutos después de la inyección de ET-1, el recipiente comienza a constreñir. Eventualmente los vasos será difícil de visualizar y el tejido cerebral se convertirá pálido. Después de unos 20 min de los efectos de ET-1 disminuye y los vasos comenzará a dilatars...

Discusión

En resumen, esta técnica de ventana craneal preparación es muy versátil ya que puede modificarse para satisfacer las necesidades de muchos experimentos con modificaciones menores ^{4, 5.} Por ejemplo, hemos logrado controlarse el flujo sanguíneo cerebral en determinadas ramas de MCA con la flujometría láser Doppler para centrarse directamente en una arteria cerebral visualizada a través de una ventana craneal (Meca AP 2009 y 2011). Además, una preparación similar con el incisa duramadre puede ser utiliz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Inhalación sistema de anestesia	VetEquip Inc., Pleasanton, California, EE.UU.	901806
El isoflurano anestesia	Baxter Farmacia, Deerfield, IL, EE.UU.	1001936060
Animal Pequeño sistema estereotáxico	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE.UU.	900
Los no ruptura bares oído, rata	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE.UU.	957
Gas Rat anestesia cabeza titular	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE.UU.	1929
BAT-12 microsonda termómetro	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.	BAT-12
T / PUMP, manta térmica	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, Nueva York, EE.UU.	T / PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.	501254
Iris fórceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.	15915
Bulldog abrazadera retractores	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.	14119-G
10 l jeringa 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.	SGE010RNS
Bovie, alta temperatura kit cauterización	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.	500392
Diente de rata fórceps 0,12	Stotz	E1811
Micromotor taladro	Stoelting,Wood Dale, IL, EE.UU.	51449
0,8 mm fresa fresa redonda	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.	RS-6280C-1
STORZ Bonn sutura Pinzas	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, EE.UU.
Sutura Nylon, tamaño 3,0	Oasis, Mettawa, IL, EE.UU.	MV-663
Esponjas de algodón	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EE.UU.	22-029-488
Puralube pomada para los ojos	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EE.UU.	NC0138063
Máquinas de cortar el pelo eléctricas	Oster, Providence, RI, EE.UU.	78005-301
ET-1 se diluye a 80 μ M de concentración en PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, EE.UU.	88-1-10A
Clorhexidina, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, EE.UU.	1040, Rev. 6.6, NAC No.: 10580322
Microscopio quirúrgico	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, EE.UU.	Evolución XR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokio, Japón	HDR-SR12
Iluminador de fibra óptica	TechniQuip Corp., Livermore, CA, EE.UU.	FO1-150
VLC Media Player	(París, Francia)
Image J software	EE.UU. Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MA, EE.UU.