Используя черепно окна для визуализации средней мозговой артерии во время эндотелина-1 Индуцированные окклюзии средней мозговой артерии

Резюме

В данной статье описывается метод визуализации головного мозга крыс артерии через черепную окно с помощью временных удаление фрагментов костей черепа, чтобы просмотреть проксимальной части средней мозговой артерии ( Рисунок 1). Этот универсальный метод может быть объединен с различными методами доставки лекарств для измерения мозговой реактивности артерий В естественных условиях.

Аннотация

Создание черепно окно является метод, который позволяет прямой визуализации структур на поверхности коры головного мозга ^1-3. Эта техника может быть выполнена во многих местах покрывающих головной мозг крыс, но наиболее легко осуществляется путем создания удаление фрагментов костей черепа более легко доступными лобной или теменной кости. Чаще всего, мы использовали этот метод в сочетании с эндотелина-1 средней мозговой артерии модели ишемического инсульта для количественной оценки изменений в средней мозговой артерии диаметром судна, которые происходят с инъекции эндотелина-1 в паренхиме головного мозга, прилегающих к проксимальной MCA ^{4, 5.} Для того, чтобы визуализировать проксимальную часть СМА во время эндотелина -1 индуцированных MCAO, мы используем технику, чтобы создать черепно окно, через височную кость на боковой аспект крысы черепа (рис. 1). Церебральных артерий могут быть визуализированы либо с твердой мозговой оболочкой нетронутыми или с оболочкой надрезанные и RetraИДКТК. Чаще всего, мы оставляем нетронутыми оболочки при визуализации, так как эндотелина-1 индуцированной MCAO включает в себя доставку сосудосуживающего пептида в паренхиму мозга. Это позволяет обойти необходимость надрезать оболочку непосредственно над визуализировать сосуды для доставки лекарств. Этот протокол описывает, как создать черепно окно для визуализации мозговых артерий в поэтапно, а также как избежать многих подводных камней, относящихся к этому методу.

протокол

Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) из Университета Флориды и в соответствии с "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных» (восьмое издание, Национальной академии наук, 2011).

Материалы

1. Животные: восемь-недельных, мужчина, Sprague Dawley крыс (Charles River Farms, Уилмингтон, Массачусетс, США) массой 250-300 г во время операции.
2. Анестезия
   1. Вдыхание анестезии системе (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA)
   2. Isoflurane анестетика (Бакстер Фармацевтика, Deerfield, IL, USA)
3. Стереотаксическая система (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Малые системы стереотаксической животных
   2. Номера для разрыва ухо баров для крыс
   3. Газ анестезии голове держатель для крыс
4. Регулирование температуры
   1. BAT-12 микрозонда термометр (WorldPrecision Instruments, Inc, Сарасота, штат Флорида, США)
   2. Т / НАСОС, TP600 тепловой одеяло (Гаймар Industries, Inc Orchard Park, Нью-Йорк, США)
5. Хирургические инструменты
   1. Metzenbaum ножницы, щипцы ирис, втягивающих бульдог зажим, 10 мкл шприц с 26 калибровочных скошенной иглой, Bovie прижигания комплект (World Precision Instruments, Inc, Сарасота, штат Флорида, США)
   2. Микромотор сверла (Stoelting, Вуд-Дейл, Иллинойс, США)
   3. 0,8 мм круглого сверла бора (Roboz хирургических инструментов Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Бонне наложения швов Пинцеты (Bausch & Lomb и, Inc, Rochester, NY, США)
6. Хирургические принадлежности
   1. 3,0 нейлона шва (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Ватные тампоны, Puralube глазная мазь (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США)
   3. Хирургическое точки и полоски (Medtronic Xomed, Inc Джексонвилле, штат Флорида, США)
   4. Электрические машинки для стрижки волос (Oster, Провиденс, Род-Айленд, США)
7. Химикалии
   1. Эндотелина-1 (Американский пептид, Саннивейл, Калифорния, США)
   2. Хлоргексидин 2% (Agrilabs, Сент-Джозеф, штат Миссури, США)
8. Визуализация оборудование
   1. Хирургический микроскоп (Seiler инструмента и производства; Сент-Луис, Миссури, США)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Минато, Токио, Япония)
   3. Волоконно-оптический осветитель (TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США)
9. Измерение диаметра сосудов
   1. VLC Media Player (Париж, Франция)
   2. Изображение J программного обеспечения (ImageJ 1.42q программного обеспечения, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США)

1. Предоперационная шаги

1. До операции у крыс размещены под 12:12 цикле свет / темнота со свободным доступом к воде и грызунов.
2. Анестезия индуцируется с 4% изофлурана в 100% O ₂ газовой смеси в индукционной камере.
3. Ворона п голова бритая, с электрической машинки для стрижки волос.
4. Крыса находится в положении лежа на впитывающей прокладки лежал на контролируемой температурой рабочей поверхности (тепловое одеяло) и руководитель находится в стереотаксической аппарата, начиная с размещением лицо противогаз анестезии.
5. Далее, ухо баров вставлены и затянуты.
6. Во время процедуры анестезии сохраняется с 2% изофлурана в 100% O ₂ газовой смеси.
7. Офтальмология мазь смазка наносится на оба глаза, а веки закрыты, чтобы предотвратить высыхание глаза во время хирургической процедуры.
8. Ректального датчика температуры вводится для поддержания постоянной температуры ядра животного 37 ± 0,5 ° C.
9. С главой наркозом крысы прочно удерживается в стереотаксической устройств хирургической области очищается с переменным солевым раствором хлоргексидина и в три раза.

2. Предварительная подготовка черепно Window

ontent "> До создания черепно окна, крысы должны быть готовы к любым экспериментам имплантации другие необходимые аппаратные и должны получать все необходимые хирургические процедуры. Для этого протокола, мы уже имплантировали канюли для эндотелина-1 (ЕТ- 1) индуцированных MCAO, как показано на собеседника издания под названием "эндотелина-1 Индуцированные средней мозговой артерии модели развития ишемического инсульта с лазерной доплеровской флоуметрии руководство в Крысы".

3. Создание черепно Window

После размещения канюли руководство или оборудования, необходимого для экспериментов, черепно окно создается непосредственно визуализировать проксимальные части средней мозговой артерии во время удара процедуры.

1. Во-первых, ножницы используются для надрезать кожу вышележащих височной мышцы, начиная медиально и параллельно работали.
2. Височной мышцы делится пополам использованием электрокоагуляции, а затем отказался от использования 3,0 нейлона шов для видеотехника тивной плоскоклеточный часть височной кости.
3. Примерно 3-4 мм квадратных обращается на плоскоклеточный часть височной кости каудально по отношению к орбите и выше основания скулового отростка, как это отражается от височной кости.
4. Сверло используется для постепенно сократить намеченные кусок кости свободной от височной кости. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать применения слишком большого давления на сверло, так как можно повредить оболочку или кору головного мозга.
5. Частые полоскания стерильным физиологическим раствором проводится для улучшения визуализации операционного поля и предотвращения перегрева черепа.
6. Начало в свободном углу, кусок temoporal кости тщательно удалены с помощью тонкой крысы-зубчатые щипцы, а убедившись, чтобы не порвать любого суда, связанные с твердой мозговой оболочкой.
7. Длительность остается неизменным и мусор смывается использованием стерильного физиологического раствора.

4. Запись головного мозга Сужение артерий

палатка "> Чтобы продемонстрировать, как захват изображений в реальном времени, крыса, которая проходит ET-1 индуцированной MCAO для этого используется протокол.

1. До применения вазоактивных соединений, базовый видео должно быть записано как минимум на 1 мин. Для ET-1 индуцированной MCAO, исходные записи производится один раз игла была снижена в паренхиме головного мозга, но до ET-1 инъекцию.
2. Шприц насос для инъекций и записанные в течение 1 часа или до желаемой конечной точки. Игла остается на месте во время записи видео в целях предотвращения нарушений фокальной плоскости.
3. Крыса должна быть глубоко анестезии и эвтаназии в соответствии с утвержденным протоколом после этой процедуры.

5. Анализ изображений

Диаметр емкости может быть определена для любой части визуализировать MCA. В качестве примера, мы будем использовать одну ветвь MCA для измерения диаметра сосуда в моменты времени до и после ET-1 инъекцию. StiLL кадры из видео захватили в 1 мин интервалом использованием VLC Media Player (VideoLAN).

1. VLC Player установлен и открыт.
2. При выборе инструментов, а затем предпочтений, установка изменится на "все" в разделе "Настройки Show".
3. "Видео меню" расширяется в левой боковой панели и "вывода", затем расширяется. "Сцена фильтры" выбран, чтобы вызвать сцену видео фильтр меню.
4. "Сцена" введет в окно префикс имени файла.
5. Префикс путь к каталогу определена. Это где кадры будут сохранены.
6. Запись Соотношение выбирается в зависимости от желаемой скорости стоп-кадра захвата. Если видео было захвачено в 29 кадров в секунду, а затем "1749" (29 кадров / сек х 60 сек / мин) должны быть введены в поле, кроме одного стоп-кадра раз в 1 мин. Все изменения будут сохранены.
7. Нужное видео, затем открыл в плеер VLC автоматически сохранять стоп-кадры раз в 1 мин.
8. Диаметр емкости затем измеряется с помощью этихизображениями. Во-первых, ImageJ программного обеспечения (NIH) открыт.
9. Тогда еще кадры, которые вы будете измерять открыты в ImageJ.
10. При выборе "анализировать" меню ", установите измерений", затем открыли и все коробки снят.
11. Далее, прямая линия инструмент выбран.
12. Сочетание клавиш "Ctrl +" используется для увеличения по мере необходимости и линии, расположенные перпендикулярно к судну путь для измерения диаметра сосуда.
13. Наконец, длина судна получается, выбрав «анализировать» меню, а затем "мера" (Ctrl + M) для получения длины судна.
14. Этот процесс повторяется, по крайней мере, в три раза и составил в среднем для каждого измеренного судна измеряется в каждом кадре.
15. Диаметр емкости в каждый момент времени нормированная на диаметр сосуда базовых, так что сравнение может быть сделано с использованием нескольких крыс. Для этого воспользуемся формулой текущего диаметра / базовый диаметр х 100% для расчета диаметра% базовой каждого судна.

Результаты

Стоп-кадры взяты из отснятого видео, показывают, что изменения в коре головного диаметра артерии после ET-1 инъекцию можно легко оценить с помощью этой техники черепно окне (рис. 2). Через несколько минут ET-1 инъекцию, судно начнет сжиматься. В конце концов суда будет трудно визуал?...

Обсуждение

Таким образом, эта методика подготовки черепно окно является очень гибким, так как он может быть изменен, чтобы удовлетворить потребности многих экспериментах с незначительными изменениями ^{4, 5.} Например, мы успешно мониторинг мозгового кровотока в отдельных отраслях MCA помощью л...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Система Вдыхание анестезии	VetEquip Inc, Pleasanton, Калифорния, США	901806
Isoflurane анестетика	Бакстер Фармацевтика, Deerfield, IL, USA	1001936060
Малые системы стереотаксической животных	David Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	900
Номера для разрыва баров ухо, крысы	David Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	957
Крысы газа анестезии голову владельцу	David Kopf Instruments, Tujunga, Калифорния, США	1929
BAT-12 микрозонда термометр	Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасота, Флорида, США	BAT-12
Т / насос, тепловые одеяла	Гаймар Industries, Inc Orchard Park, Нью-Йорк, США	Т / НАСОС, TP600
Metzenbaum ножницы	Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасота, Флорида, США	501254
Iris щипцы	Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасота, Флорида, США	15915
Бульдог зажим преднатяжителями	Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасота, Флорида, США	14119-G
10 мкл шприц 26-gaugue	Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасота, Флорида, США	SGE010RNS
Bovie, высокая температура комплект прижигания	Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасота, Флорида, США	500392
Крысы зуба щипцы 0,12	Stotz	E1811
Микромотор сверло	Stoelting,Вуд-Дейл, Иллинойс, США	51449
0,8 мм круглого бора сверло	Roboz хирургических инструментов Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Бонне наложения швов щипцы	Bausch & Lomb и, Inc, Rochester, NY, USA
Нейлон швов, размер 3,0	Oasis, Mettawa, Иллинойс, США	MV-663
Ватные тампоны	Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	22-029-488
Puralube глазная мазь	Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США	NC0138063
Электрические машинки для стрижки волос	Остер, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 разбавляют до 80 μ M концентрация в PBS	Американский пептидов, Саннивейл, Калифорния, США	88-1-10А
Хлоргексидин, 2%	Agrilabs, Сент-Джозеф, Миссури, США	1040, преподобный 6-06, NAC №: 10580322
Операционный микроскоп	Seiler инструмента и производства, Сент-Луис, Миссури, США	Эволюция XR6
Sony Handycam	Sony, Минато, Токио, Япония	HDR-SR12
Оптоволоконный осветитель	TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США	FO1-150
VLC Media Player	(Париж, Франция)
Изображение J программного обеспечения	США Национальные Институты Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США