Mit Hilfe eines Cranial Fenster, um den Nahen Cerebral Artery Während Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Visualisieren

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Visualisierung rat Hirnarterien durch ein Schädel-Fenster mit zeitlicher Kraniektomie um proximalen Abschnitte der mittleren Hirnarterie anzusehen ( Abbildung 1). Diese Methode lässt sich mit verschiedenen Techniken von Drug-Delivery kombiniert werden, um Hirnarterie Reaktivität zu messen In vivo.

Zusammenfassung

Erstellung eines Schädel-Fenster ist eine Methode, die eine direkte Visualisierung der Strukturen ermöglicht auf der kortikalen Oberfläche des Gehirns ^1-3. Diese Technik kann an verschiedenen Orten, die über der Ratte Cerebrum durchgeführt werden, sondern ist am einfachsten durch die Schaffung eines Kraniektomie über den leicht zugänglichen frontalen oder Scheitelbeine durchgeführt. Am häufigsten haben wir diese Technik in Kombination mit dem Endothelin-1 cerebri Arterienverschluss Modell eines ischämischen Schlaganfalls, um die Änderungen in der mittleren zerebralen Arterie Gefäßdurchmesser, der mit Einspritzung von Endothelin-1 treten in das Hirnparenchym angrenzend an das proximale MCA quantifizieren ^{4, 5.} Um den proximalen Abschnitt des MCA während Endothelin induzierten -1 MCAO visualisieren, verwenden wir eine Technik, um ein Fenster durch die kraniale Schläfenbein auf der lateralen Seite des Schädels Ratte (Abbildung 1) zu schaffen. Hirnarterien können entweder mit der Dura intakt oder mit der Dura eingeschnitten und retra visualisiert werdenCTED. Am häufigsten, verlassen wir die Dura intakt während der Visualisierung, da Endothelin-1-induzierten MCAO beinhaltet Lieferung der gefäßverengende Peptids in das Hirnparenchym. Dies umgeht die Notwendigkeit, die Dura direkt über einzuschneiden visualisierter Behältern zur Medikamentenabgabe. Dieses Protokoll wird beschrieben, wie ein Schädel Fenster Hirnarterien in einer stufenweisen Weise visualisieren, und wie viele der möglichen Gefahren im Zusammenhang mit dieser Methode zu vermeiden erstellen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Florida zugelassen und ist in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (achte Auflage National Academy of Sciences, 2011).

Materialien

1. Tiere: Acht-Wochen-alt, männlich, Sprague Dawley Ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) mit einem Gewicht von 250-300 g zum Zeitpunkt der Operation.
2. Anästhesie
   1. Inhalationsanästhesie System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Isofluran Narkose (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL, USA)
3. Stereotaktische System (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Kleintier stereotaktischen Systems
   2. Non-Ruptur Ohr Bars für Ratten
   3. Gas Anästhesie Kopfhalter für Ratten
4. Temperatur-Regelung
   1. BAT-12 Mikrosonde Thermometer (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. T / PUMP, TP600 Thermal Decke (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Chirurgische Instrumente
   1. Metzenbaumschere, Iris Pinzette, bulldog clamp Retraktoren, 10 ul Spritze mit 26 Gauge abgeschrägte Nadel, Bovie Kauter Kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. Mikromotor Bohrer (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm Rosenbohrer bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn Naht-Zange (Bausch und Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
6. Surgical Supplies
   1. 3,0 Nylonnaht (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Wattestäbchen, Puralube Augensalbe (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
   3. Chirurgische Punkte und Streifen (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, USA)
   4. Haarschneidemaschine (Oster, Providence, RI, USA)
7. Chemicals
   1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
8. Visualisierung Ausrüstung
   1. Operationsmikroskop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokio, Japan)
   3. Fiber Optic Illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
9. Messung der Gefäßdurchmesser
   1. VLC media player (Paris, Frankreich)
   2. Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

Ein. Präoperative Steps

1. Vor der Operation werden die Ratten unter einem 12:12 Hell / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Nagetierfutter untergebracht.
2. Narkose mit Isofluran in 4% 100% O _2-Gasgemisch in einer Induktionskammer induziert.
3. Die Krähe n des Kopfes mit elektrischen Haarschneidemaschinen rasiert.
4. Die Ratte wird in einer Bauchlage auf einem saugfähigen Kissen, das auf einer Temperatur-gesteuerten Bedienfläche (Wärmedecke) und der Kopf wird in der stereotaktischen Vorrichtung beginnend mit Plazierung des Gases Anästhetikum Gesichtsmaske platziert.
5. Anschließend werden die Stäbe Ohr eingesetzt und verschlossen.
6. Während des Verfahrens Anästhesie mit 2% Isofluran in 100% O _2-Gasgemisch aufrechterhalten wird.
7. Ophthalmischen Schmiermittels Salbe wird auf beide Augen aufgetragen und die Augenlider geschlossen sind, um Austrocknung Auges während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.
8. Rektale Temperatursonde eingeführt wird, um eine konstante tierischen Kerntemperatur von 37 ± 0,5 ° C zu halten
9. Mit dem Kopf der narkotisierten Ratte fest in der Vorrichtung gehalten stereotaxischen der chirurgische Umgebung gereinigt mit alternierenden Chlorhexidin und Kochsalzlösung dreimal.

2. Pre-kranialen Fenster Vorbereitung

nhalt "> Vor Erstellung einer kranialen Fenster sollte der Ratte für jegliche Experimente durch Implantation von anderen benötigten Hardware hergestellt werden sollten und alle notwendigen chirurgischen Eingriffe erhalten. Aus diesem Protokoll, wir zuvor eine Führungskanüle für Endothelin-1 (ET-implantierten 1) induzierte MCAO wie in einem Begleiter Publikation mit dem Titel angezeigt "Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Ratte."

3. Schaffung des Cranial Fenster

Nach Platzierung einer Führungskanüle oder Einrichtungen für die Experimente erforderlich, wird eine Schädelknochen Fenster erzeugt, um direkt visualisieren proximalen Abschnitte der mittleren zerebralen Arterie während eines Hubes Prozedur.

1. Zunächst werden Schere verwendet, um die Haut über dem M. temporalis ab medial und Arbeitsbedingungen seitlich einschneiden.
2. Der M. temporalis wird halbiert mit Elektrokauter und dann zurückgezogen mit 3,0 Nylonnaht zu visua kristallisieren die Plattenepithelkarzinome Teil des Schläfenbein.
3. Ein ca. 3-4 mm Platz ist auf dem Plattenepithel Teil des Schläfenbein kaudal der Umlaufbahn und überlegen der Basis des Processus zygomaticus gezogen, wie es reflektiert der zeitlichen Knochen.
4. Ein Bohrer wird verwendet, um allmählich schneiden die skizzierten Stück Knochen frei von Schläfenbein. Es ist darauf zu vermeiden, dass zu viel Druck auf die Bohrmaschine da es möglich, die Dura oder Großhirnrinde beschädigen ist.
5. Häufige Spülungen mit steriler Kochsalzlösung durchgeführt werden, um die Visualisierung des OP-Feld zu verbessern und verhindern eine Überhitzung des Schädels.
6. Ab einer losen Ecke wird das Stück temoporal Knochen vorsichtig entfernt mit feinen rat-gezahnten Pinzette gleichzeitig dafür, dass keine Schiffe mit der Dura verbunden reißen.
7. Die Dura intakt bleibt und Schutt weg mit steriler Kochsalzlösung gespült.

4. Aufzeichnung von Cerebral Artery Constriction

Zelt "> Um zu demonstrieren, wie Sie Bilder in Echtzeit, eine Ratte, die durchlaufen ET-1-induzierten MCAO ist zu erfassen ist für dieses Protokoll verwendet.

1. Vor dem Aufbringen des vasoaktiven Verbindungen sollten eine Grundlinie Video für mindestens 1 min aufgezeichnet. Für ET-1-induzierten MCAO wird die Basislinie Aufzeichnung erfolgt, wenn die Nadel in das Hirnparenchym abgesenkt worden, aber vor der ET-1 Injektion.
2. Die Spritzenpumpe wird zur Injektion begonnen und aufgezeichnet für 1 Stunde oder bis zum gewünschten Endpunkt. Die Nadel wird in die während Videoaufzeichnung belassen, um Störungen der Fokalebene zu verhindern.
3. Die Ratte sollte tief betäubt und eingeschläfert nach einer genehmigten Protokoll des folgenden Verfahrens.

5. Image Analysis

Gefäßdurchmesser kann für einen beliebigen Teil der visualisierten MCA bestimmt werden. Als Beispiel verwenden wir ein Zweig der MCA zu Behälterdurchmesser bei Zeit-Punkten messen vor und nach ET-1 Injektion. Still Frames aus dem Video werden auf 1 min Abständen mit VLC media player (VideoLAN) erfasst.

1. VLC Player installiert und geöffnet.
2. Durch Auswahl von Werkzeugen und Vorlieben, wird die Einstellung auf "All" unter veränderten "Einstellungen anzeigen".
3. Der "Video-Menü" in der linken Navigationsleiste erweitert und "Output Module" wird dann erweitert. "Scene Filter" ausgewählt wird, um die Szene Videofilter Menü.
4. "Szene" in den Kasten für Dateinamenpräfix getippt.
5. Ein Verzeichnispfad Präfix definiert. Dies ist, wo Standbilder gespeichert werden.
6. Aufzeichnungs-Verhältnis wird auf der Basis der gewünschten Geschwindigkeit der Standbild-Capture ausgewählt. Wenn ein Video mit 29 Frames pro Sekunde, dann "1749" (29 Bilder / sec x 60 sec / min) erfasst wurde, sollte in der Box eingegeben werden, um zu sparen ein Standbild alle 1 min. Alle Änderungen werden dann gespeichert.
7. Die gewünschte Video wird dann im VLC-Player geöffnet werden, um automatisch noch retten Frames einmal pro 1 min.
8. Gefäßdurchmesser wird dann mit diesenBilder. Zuerst wird ImageJ Software (NIH) geöffnet.
9. Dann werden die Standbilder, die Sie messen in ImageJ geöffnet.
10. Durch die Auswahl der "analysieren" Menü "gesetzt Messungen" wird dann geöffnet und alle Boxen deaktiviert sind.
11. Als nächstes wird die gerade Linie Werkzeug ausgewählt.
12. Die Tastenkombination "Strg +" wird verwendet, um in nach Bedarf vergrößern und eine Linie senkrecht zur Schiffes Weg zum Gefäßdurchmesser zu messen.
13. Schließlich wird Gefäßlänge, indem Sie die "analysieren" Menü und dann "Maßnahme" (Strg + M) in den Behälter Länge zu erhalten erhalten.
14. Dieser Vorgang wird mindestens dreimal wiederholt und gemittelt für jede gemessene Gefäß in jedem Standbild gemessen.
15. Gefäßdurchmessers zu jedem Zeitpunkt an der Grundlinie Gefäßdurchmesser normiert, so dass Vergleiche können unter Verwendung mehrerer Ratten werden. Um dies zu tun, verwenden Sie die Formel aktuellen Durchmesser / Baseline Durchmesser x 100% die% Baseline Durchmesser jedes Schiff zu berechnen.

Ergebnisse

Standbilder von der Videoaufnahme entnommen wurden, zeigen, dass die Veränderung in Hirnarterie Durchmesser nach ET-1 Injektion kann leicht erkannt werden, mit dieser kranialen Fenster-Technik (Abbildung 2). Innerhalb von Minuten nach ET-1 Injektion wird das Schiff beginnt zu verengen. Schließlich die Gefäße schwierig sein wird, zu visualisieren und das Gehirngewebe wird bleich. Nach ca. 20 min die Auswirkungen von ET-1 wird abnehmen und die Gefäße beginnen zu erweitern, allmählich wieder auf den...

Diskussion

Zusammenfassend ist das kraniale Fenster Präparationstechnik sehr vielseitig wie sie kann geändert werden, um den Anforderungen vieler Versuche mit geringfügigen Modifikationen ^{4, 5} erfüllen. Zum Beispiel haben wir erfolgreich zerebralen Blutflusses in bestimmten MCA Niederlassungen mittels Laser-Doppler-Flussmessung direkt konzentrieren sich auf eine Hirnarterie visualisiert durch ein Schädel-Fenster (Mekka AP 2009 und 2011) überwacht. Zusätzlich kann eine ähnliche Zubereitung mit der Dura mit einges...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Inhalationsanästhesie System	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isofluran Narkose	Baxter Pharmazie, Deerfield, IL, USA	1001936060
Kleintier stereotaktischen Systems	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-Ruptur Ohr Bars, Ratte	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat Gas Anästhesie Kopfhalter	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 Mikrosonde Thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T / PUMP, Thermal Decke	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T / PUMP, TP600
Metzenbaumschere	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris Pinzette	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog Klemme Retraktoren	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14.119-G
10 &mgr; l-Spritze 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, Hochtemperatur Kauter Kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat Zahn-Zange 0,12	Stotz	E1811
Mikromotor Bohrer	Stoelting,Wood Dale, IL, USA	51449
0,8 mm Rosenbohrer bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn Naht Pinzette	Bausch & Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Naht, Größe 3,0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Wattestäbchen	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	22-029-488
Puralube Augensalbe	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	NC0138063
Haarschneidemaschine	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 bis 80 μ M Konzentration in PBS verdünnt	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidin, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6.6, NAC-Nr: 10580322
Operationsmikroskop	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution XR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokio, Japan	HDR-SR12
Faseroptik-Lichtquelle	TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA	FO1-150
VLC Media Player	(Paris, Frankreich)
Image J Software	US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA