Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Resumo

Este artigo descreve um método para a visualização de artérias cerebrais de rato através de uma janela craniana via craniectomia temporal, a fim de visualizar partes proximais da artéria cerebral média ( Figura 1). Este método versátil, pode ser combinada com várias técnicas de administração de fármacos para medir a reactividade da artéria cerebral In vivo.

Resumo

Criação de uma janela craniana é um método que permite a visualização directa das estruturas sobre a superfície cortical do cérebro ^1-3. Esta técnica pode ser realizada em diversos locais do cérebro de rato que se sobrepõem, mas é mais facilmente realizado através da criação de uma craniectomia sobre os ossos de fácil acesso frontal ou parietal. Mais frequentemente, temos usado esta técnica, em combinação com o modelo de oclusão endotelina-1 na artéria cerebral média de AVC isquémico para quantificar as alterações no diâmetro dos vasos da artéria cerebral média, que ocorrem com a injecção de endotelina-1 para o parênquima cerebral adjacente ao MCA proximal ^{4, 5.} A fim de visualizar a porção proximal da MCA, durante endotelina -1 induzida MCAO, usamos uma técnica para criar uma janela craniana no osso temporal na face lateral do crânio de rato (Figura 1). Artérias cerebrais pode ser visualizada quer com a dura intacta ou com a dura-máter e incisa RetraCTED. Mais comumente, deixamos a dura intacta durante a visualização desde a endotelina-1 induzida por MCAO envolve a entrega do péptido vasoconstritor para o parênquima cerebral. Isto evita a necessidade de incisão na dura directamente sobre os vasos visualizado para a entrega da droga. Este protocolo irá descrever como criar uma janela craniana para visualizar artérias cerebrais de uma forma faseada, bem como a forma de evitar muitas das armadilhas potenciais referentes a este método.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade da Flórida e está em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" (oitava edição, a National Academy of Sciences, 2011).

Materiais

1. Animais: Oito semanas de idade, macho, Sprague Dawley (Farms Charles River, Wilmington, MA, EUA) pesando 250-300 g no momento da cirurgia.
2. Anestesia
   1. Sistema de anestesia por inalação (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA)
   2. Anestésico isoflurano (Baxter Farmacêutica, em Deerfield, Illinois, EUA)
3. Estereotáxico sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA)
   1. Sistema estereotáxico de pequenos animais
   2. Não-ruptura de ouvido barras para ratos
   3. Gás titular cabeça anestesia para ratos
4. Regulação da temperatura
   1. BAT-12 termômetro microssonda (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA)
   2. T / BOMBA, TP600 manta térmica (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, EUA)
5. Instrumentos cirúrgicos
   1. Metzenbaum tesoura, íris fórceps, afastadores braçadeira bulldog, seringa de 10 ul com agulha de calibre 26 chanfrado, Bovie cautério kit (Precision Mundial Instruments, Inc., Sarasota, Flórida, EUA)
   2. Micromotor broca (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA)
   3. 0,8 milímetros rodada broca broca (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EUA)
   4. STORZ Bonn Sutura Pinças (Bausch e Lomb, Inc., Rochester, NY, EUA)
6. Material cirúrgico
   1. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EUA)
   2. Cotonetes, pomada Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)
   3. Pontos cirúrgicos e tiras (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, EUA)
   4. Elétrica de cortar cabelo (Oster, Providence, RI, EUA)
7. Produtos químicos
   1. A endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EUA)
   2. Clorexidina 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EUA)
8. Equipamento de visualização
   1. Microscópio cirúrgico (Seiler Instrumento e Manufatura; St. Louis, MO, EUA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japão)
   3. Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA)
9. Medição do diâmetro do vaso
   1. VLC media player (Paris, França)
   2. Image J software (ImageJ 1.42q software, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA)

1. Pré-cirúrgicos Passos

1. Antes da cirurgia, os ratos são alojados sob um ciclo de luz / escuridão 12:12, com livre acesso à água e à ração de roedores.
2. A anestesia é induzida com 4% de isoflurano em 100% de mistura de gás _O2, em uma câmara de indução.
3. O corvo n da cabeça é raspada com cortar cabelo elétrica.
4. O rato é colocado numa posição de bruços sobre uma almofada absorvente encontra-se sobre uma superfície de funcionamento com temperatura controlada (manta térmica) e a cabeça é colocada no aparelho estereotáxico de partida com a colocação da máscara de gás anestésico.
5. Em seguida, as barras de orelha são inseridos e apertados.
6. Durante o procedimento de anestesia é mantida com isoflurano a 2% em 100% de mistura de gás de O _2.
7. Pomada lubrificante oftálmico é aplicada em ambos os olhos e as pálpebras são fechadas para evitar ressecamento dos olhos durante o procedimento cirúrgico.
8. Uma sonda de temperatura rectal é inserido para manter uma temperatura constante de animais núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
9. Com a cabeça do rato anestesiado firmemente mantido no dispositivo estereotáxico da área cirúrgica é lavada com a alternância de clorexidina e solução salina três vezes.

2. Pré-craniana Preparação Janela

ONTEÚDO "> Antes de criar uma janela craniana, o rato deve estar preparado para todas as experiências de implantação de hardware necessário outro e deve receber quaisquer procedimentos necessários cirúrgicos. Para este protocolo, já implantada uma cânula guia para endotelina-1 (ET- 1) induzida OACM como mostra uma publicação companheiro intitulado "A endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação dopplerfluxometria em rato."

3. Criação da Janela craniana

Após a colocação de uma cânula guia ou equipamento necessário para a experimentação, uma janela craniana é criado para visualizar diretamente porções proximais da artéria cerebral média, durante um procedimento de acidente vascular cerebral.

1. Em primeiro lugar, são utilizadas tesouras a incisão da pele que cobre o músculo temporal e medialmente começando a trabalhar lateralmente.
2. O músculo temporal é cortada utilizando o eletrocautério, e depois recuou 3,0 utilizando fio de náilon ao vi lize a escama do osso temporal.
3. Um quadrado de aproximadamente 3-4 milímetros é desenhada na parte escamosa do osso temporal caudal para a órbita e superior para a base do processo zigomático uma vez que reflecte para fora do osso temporal.
4. Uma broca é utilizada para reduzir gradualmente o pedaço de osso esboçada livre a partir do osso temporal. Deve ser tomado cuidado para evitar a aplicação de pressão excessiva ao perfuração uma vez que é possível danificar a dura ou no córtex cerebral.
5. Lavagens freqüentes com solução salina estéril são realizadas para melhorar a visualização do campo cirúrgico e evitar o superaquecimento do crânio.
6. A partir de um canto solto, o pedaço de osso temoporal é cuidadosamente removido usando finas rato de dentes fórceps enquanto tomando cuidado para não rasgar os vasos associados com a dura.
7. A dura-máter é deixada intacta e detritos é lavado com solução salina estéril.

4. Gravação de constrição da artéria cerebral

> tenda "Para demonstrar como a captura de imagens em tempo real, um rato que está passando por ET-1 induzida OACM é usado para esse protocolo.

1. Antes da aplicação de compostos vasoactivos, uma linha de base de vídeo deve ser registada durante pelo menos 1 min. Para ET-1 induzida por MCAO, a gravação é feita referência, uma vez que a agulha tenha sido baixada para dentro do parênquima do cérebro, mas antes da injecção de ET-1.
2. A bomba de seringa é iniciado por injecção e registados durante 1 hora ou até que o ponto final desejado. A agulha é deixada no local durante a gravação de video, a fim de evitar perturbações no plano focal.
3. O rato deve ser profundamente anestesiados e sacrificados de acordo com um protocolo aprovado seguindo este procedimento.

5. Análise de Imagem

Diâmetro do vaso pode ser determinada para qualquer parte do MCA visualizado. Como exemplo, vamos usar um ramo da MCA para medir o diâmetro dos vasos em tempo-pontos antes e depois da injeção de ET-1. Still quadros do vídeo são capturados em intervalos de 1 min usando VLC media player (VideoLAN).

1. VLC player está instalado e aberto.
2. Ao selecionar ferramentas e, em seguida, as preferências, o cenário é alterado para "Todos" em "Mostrar configurações".
3. O menu "vídeo" é ampliado na barra do lado esquerdo e "Módulos de saída" é então expandido. "Filtros de Cena" é selecionado para abrir o menu de vídeo cena filtro.
4. "Scene" é digitado na caixa de prefixo do nome.
5. Um prefixo caminho do diretório está definido. Este é o lugar onde ainda quadros são salvos.
6. Um rácio de gravação é seleccionado com base na taxa desejada de captura de quadros. Se um vídeo foi capturado em 29 frames por segundo, em seguida, "1749" (29 frames / seg x 60 seg / min) deve ser inserido na caixa para salvar uma ainda enquadrar cada 1 min. Todas as mudanças são salvos.
7. O vídeo desejado é então aberto em player VLC para salvar automaticamente quadros ainda uma vez a cada 1 min.
8. Diâmetro do vaso é então medida utilizando estesimagens. Em primeiro lugar, o software ImageJ (NIH) é aberta.
9. Em seguida, os quadros ainda que você vai medir são abertos no ImageJ.
10. Ao selecionar a "analisar" menu ", definir medidas" é então aberto e todas as caixas estão desmarcadas.
11. Em seguida, a ferramenta de linha reta é selecionada.
12. O atalho "Ctrl +" é usado para fazer zoom conforme necessário e uma linha é colocado perpendicularmente ao caminho vaso para medir o diâmetro do vaso.
13. Finalmente, comprimento do vaso é obtida selecionando a "analisar" no menu e, em seguida, "medida" (ctrl + M) para obter comprimento do vaso.
14. Este processo é repetido pelo menos três vezes, e calculada a média para cada recipiente de medição medidos em cada fotograma.
15. Diâmetro do vaso em cada ponto de tempo é normalizado para o diâmetro do vaso de linha de base de modo a que possam ser feitas comparações múltiplas utilizando ratos. Para fazer isso, utilizar a fórmula diâmetro diâmetro / corrente de linha de base x 100% para calcular o diâmetro da linha de base% de cada vaso.

Resultados

As imagens fixas tiradas do programa de vídeo captada que a mudança de diâmetro da artéria cerebral após a injecção de ET-1 pode ser facilmente observado utilizando esta técnica janela craniana (Figura 2). Poucos minutos após a injeção de ET-1, o navio começará a se contrair. Eventualmente, os vasos será difícil de visualizar o tecido cerebral e irá tornar-se clara. Após cerca de 20 min os efeitos de ET-1 irá diminuir e os vasos começará a dilatar gradualmente voltando ao diâmetro d...

Discussão

Em resumo, esta técnica de preparação de janela craniana é muito versátil uma vez que podem ser alterados para satisfazer as necessidades das várias experiências com pequenas modificações, ^{4, 5.} Por exemplo, conseguimos monitorado o fluxo sanguíneo cerebral em ramos específicos MCA usando a dopplerfluxometria a laser para se concentrar diretamente em uma artéria cerebral visualizado através de uma janela de crânio (Meca AP 2009 e 2011). Além disso, uma preparação semelhante com a incisão dur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Sistema de anestesia por inalação	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA	901806
Anestésico isoflurano	Pharmaceutics Baxter, Deerfield, IL, EUA	1001936060
Sistema estereotáxico de pequenos animais	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA	900
Não-ruptura barras de ouvido de ratos,	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA	957
Rat gás suporte da cabeça anestesia	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA	1929
BAT-12 termômetro microssonda	Precisão mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA	BAT-12
T / BOMBA, manta térmica	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, EUA	T / BOMBA, TP600
Metzenbaum Tesoura	Precisão mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA	501254
Iris fórceps	Precisão mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA	15915
Afastadores bulldog braçadeira	Precisão mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA	14119-G
Seringa de 10 ul de 26 gaugue	Precisão mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA	SGE010RNS
Bovie, kit cautério alta temperatura	Precisão mundo Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA	500392
Dente rato fórceps 0,12	Stotz	E1811
Broca Micromotor	Stoelting,Wood Dale, IL, EUA	51449
0,8 broca de perfuração milímetros rodada	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EUA	RS-6280C-1
STORZ Bonn sutura fórceps	Bausch e Lomb, Inc., Rochester, NY, EUA
Nylon de sutura, de tamanho 3,0	Oasis, Mettawa, IL, EUA	MV-663
Cotonetes	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA	22-029-488
Puralube pomada	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA	NC0138063
Elétrica de cortar cabelo	Oster, Providence, RI, EUA	78005-301
ET-1 diluído a 80 μ M de concentração em PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, EUA	88-1-10A
Clorexidina, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, EUA	1040, Rev. 6-06, NAC n º: 10580322
Microscópio cirúrgico	Seiler Instrumento e Manufatura, St. Louis, MO, EUA	Evolução XR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japão	HDR-SR12
Iluminador de fibra óptica	TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA	FO1-150
VLC Media Player	(Paris, França)
Image J software	EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA