ماوس نموذج مثلي من سرطان الغدة الدرقية كشمي

Summary

يوصف جيل من نموذج الفأر مثلي من سرطان الغدة الدرقية كشمي هنا. هذه التقنية توظف التنسيب الجراحية للكشمي خلايا سرطان الغدة الدرقية الإنسان في الغدة الدرقية من الفئران العوز المناعي، وبالتالي خلق بيئة أكثر سريريا ذات الصلة لدراسة تطور المرض وكذلك شاشة التدخلات العلاجية المبتكرة.

Abstract

وقد أنشئت عدة أنواع من نماذج حيوانية من سرطان الغدة الدرقية الإنسان، بما في ذلك تحت الجلد طعم أجنبي وزرع مثلي من الخلايا السرطانية في الفئران العوز المناعي. كانت تحت الجلد نماذج طعم أجنبي قيمة لفحص ما قبل السريرية وتقييم العلاجات علاجية جديدة. هناك عدد من المزايا لاستخدام نموذج تحت الجلد؛ 1) السريع، 2) قابلة للتكرار، و3) إنشاء الورم، والنمو، واستجابة لعوامل علاجية يمكن رصدها عن طريق التفتيش البصري. ومع ذلك، أدلة قوية وتسليط الضوء على مجيء قصيرة من تحت الجلد طعم أجنبي نماذج ^1-3. على سبيل المثال، والعلاجات الطبية مما يدل الخصائص العلاجية في نماذج طعم أجنبي تحت الجلد غالبا ما يكون لها تأثير ملحوظ على الأمراض التي تصيب البشر. المكروية للموقع من زرع أو حقن xenographic يكمن في قلب هذا الاختلاف.

مثلي نماذج طعم أجنبي الورم توفير المزيد من المواالسياق gically ذات الصلة التي لدراسة المرض. مزايا زرع الخلايا المريضة أو الأنسجة في ما يعادلها الأصل التشريحية داخل الحيوان المضيف يتضمن موقع مناسب للتفاعل ورم المضيف، وتطوير الانبثاث الأمراض ذات الصلة والقدرة على دراسة تأثير مواقع محددة على العلاجات العلاجية الفحص. ولذلك، نماذج طعم أجنبي مثلي تؤوي قيمة أكثر بكثير السريرية لأنها تتكاثر بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر. لهذه الأسباب، قد اتخذت عددا من الجماعات الاستفادة من نموذج سرطان الغدة الدرقية مثلي كأداة بحث ^4-7.

هنا، نحن تصف النهج الذي يؤسس نموذج مثلي لدراسة سرطان الغدة الدرقية كشمي (ATC)، والذي هو الغازية للغاية، وتقاوم العلاج، ومميت تقريبا في جميع المرضى الذين شخصت. وتعد الخلايا ATC مثقف وتعليق الخلوية فصلها في محلول يحتوي على مصفوفة الغشاء القاعدي. حجم صغير ببطء وينجected في حق الغدة الدرقية. يتم مراقبة المظهر العام وصحة الفئران لضمان الحد الأدنى من مضاعفات ما بعد الجراحة وقياس انتفاذ المرضية للسرطان. يتم التضحية الفئران في 4 أسابيع، ويتم جمع الأنسجة للتحليل النسيجي. يمكن أن تؤخذ الحيوانات في وقت لاحق نقاط الوقت لدراسة أكثر تقدم مسبقا من المرض. إنتاج هذا نموذج الفأر مثلي يؤسس منبرا أن يحقق هدفين: 1) زيادة فهمنا لعلم الأمراض ATC، و 2) شاشة العوامل العلاجية الحالية والمستقبلية للفعالية في مكافحة ATC.

Protocol

1. إعداد الخلية

ملاحظات: 1) كاملة المتوسط ​​1640 القائمة على الثقافة الإعلامية وصفة (500 مل) ويشمل 435 مل RPMI 1640، 50 مل FBS الحرارة المعطل، 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل البيروفات الصوديوم، 5 مل مضاد حيوي مضاد فطري؛ 2) مكان matrigel في 4 درجات مئوية يوم واحد قبل الحصاد الخلية.

1. الإنسان ATC خط الخلية THJ-11T تزرع ⁸ في 6 لوحات ثقافة جيدا وتحصد مرة واحدة 80-90٪ متموجة.
2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. نضح وسائل الإعلام والخلايا resuspend في المتوسط ​​1640 وسائل الإعلام [2 مل / 6 لوحة جيدا].
4. تأخذ كمية صغيرة من تعليق الخلية، إضافة إلى حجم واحد من 0.4٪ التريبان الأزرق صبغ وتحديد كثافة الخلية باستخدام TC10 الآلي عداد الخليوي.
5. حساب حجم التعليق الخلية اللازمة للحصول على 5 × 10 ⁵ خلية / الماوس أضعاف عدد الفئران عن طريق الحقن.

ملاحظة: لضمان إعلان مساواة تعليق خلية للحقن، وإعداد الخلايا كما لو كنت بالحقن ضعف عدد الفئران (على سبيل المثال إذا حقن الفئران 5، ثم إعداد تعليق خلية كما لو كنت حقن الفئران 10).

6. نقل حجم الحاجة من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
7. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. نضح وسائل الإعلام والخلايا resuspend في المتوسط ​​1640 كاملة وسائل الاعلام.
9. نقل الخلايا إلى أنبوب مل 1.6، إضافة 1 حجم matrigel وتخلط بلطف بواسطة pipetting ببطء داخل وخارج.

ملاحظة: سوف تتلقى كل الماوس 10 ميكرولتر من تعليق / matrigel خلية كوكتيل. منذ 5 × 10 ⁵ خلايا معلقة في 10 ميكرولتر حجم عن طريق الحقن وقد استخدمت بنجاح في الدراسات ATC مثلي السابقة ^9-10، استخدمنا تلك المعلمات في هذا التقرير.

10. ضع تعليق خلية على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.

_title "> 2. إعداد ماوس

1. تنظيف المنطقة الجراحية، والذي يتضمن نطاق تشريح والمنطقة المحيطة بها، من خلال مسح جميع الأسطح مع الايثانول 70٪.
2. بدوره على مصابيح التدفئة / منصات الحيوانات حيث سيتم يتعافى من عملية جراحية.
3. إدارة 0.1 مل الكيتامين / زيلازين (كوكتيل المخدرات تتألف من الكيتامين 9 ملغ / مل وزيلازين 1mg/ml) لكل 10 غرام من وزن الجسم الغشاء البريتونى باستخدام 1 مل، 27G ½ "السلين المحقنة.
4. الإعدادية الماوس لإجراء عملية جراحية: 1) حلاقة منطقة الرقبة من الماوس (من خط الفك السفلي إلى العلوي من عظمة القص وإلى الأسلحة)، 2) فرك منطقة العمليات الجراحية ثلاث مرات مع chorhexadine الساحات الشاش غارقة، 3) فرك النهائي فعلت مع بتدين الشاش غارقة، 4 ) بلطف تطبيق مرهم العين لمنع العينين من التجفيف.
5. فحص دواسة المنعكس لضمان مخدرا الماوس على نحو كاف.
6. وضع الحيوان في الاستلقاء على ظهري حاجز حقل معقمة القابل للتصرف ضمن نطاق تشريح وتأمين الحيوانية في مكان مع شريط من القماش.
7. الدعك اليدين وجمعةثم وضع ingernails على القفازات الجراحية المعقمة.
8. بطريقة عقيمة، حزمة الجراحة المفتوحة وترتيب الصكوك.
9. وضع الستارة العقيمة على الحيوان، وترك موقع الجراحية فقط عرضة للخطر.

3. الدخول جراحية لالغدة الدرقية وحقن الخلايا

1. باستخدام العقيمة، مشرط القابل للتصرف، وجعل شق طولي 1 إلى 1.5 سم على طول خط الوسط من الحلق.

ملاحظة: الانحراف عن خط الوسط يعقد أعمق القطع للوصول إلى القصبة الهوائية. إلى حد ما دقيقة شق خط الوسط يسمح لك لندف وقطع طريق الأنسجة الغشائية عقد الغدد اللعابية اليسار واليمين معا، ويقلل من فرصة من الخدش أو قطع الشرايين الكبيرة.

2. جعل شق الثانية في العضلات المحيطة حزام القصبة الهوائية ثم سحب الجانب الأيمن من عضلة قطعي إلى الجانب لفضح حق الغدة الدرقية.
3. المرقأة يمكن استخدامها في هذه المرحلة لعقد طبقة العضلاتجزء لسهولة الوصول إلى الغدة الدرقية (الشكل 1).

ملاحظة: بدلا من ذلك، إذا الإجراء يقوم بها اثنان من موظفي العمليات الجراحية، قد ببساطة سيعقد طبقة العضلات مرة أخرى مع ملقط في حين يتم تسليم حقنة تعطى عن طريق الحقن جاهزة للجراح من قبل مساعدة الموظفين.

4. حقن ببطء 10 ميكرولتر من تعليق خلية في الغدة الدرقية باستخدام حق 31G 5/16 "حقنة الانسولين ثم إزالة بلطف إبرة.

4. إغلاق موقع الجراحة والإنعاش ماوس

1. طبقة العضلات خياطة مع 6.0 مواد خياطة باستخدام إما نمط خياطة مستمرة أو متقطعة.
2. غرزة الجلد في نفس الشكل.
3. ضع طبقة من مرهم مضاد حيوي الثلاثي مباشرة عبر موقع شق.
4. تسمح حيوان لاسترداد في الاستلقاء على ظهري وسادة التدفئة الحارة. مرة واحدة الحيوان يمكن تحقيق الاستلقاء القصية دون مساعدة، ويمكن وضعها مرة أخرى مع الفئران الأخرى.

<فئة P = "jove_title"> 5. الرصد اللاحقة للعمليات الجراحية ومجموعة الأنسجة

1. تحقق من موقع شق والصحة العامة للحيوان يوميا لمدة أسبوع بعد الجراحة، ثم تحقق مرة واحدة في الأسبوع. إذا كانت الغرز لا تزال على حالها بعد 14 يوما، تتم إزالتها.

ملاحظة: يجب أن الحيوانات اظهار علامات تدهور صحة (مثل فقدان الوزن كبيرة، والشعر ضيع، مع ضيق التنفس) يتم التخلص والأنسجة التي تم جمعها.

2. مرة واحدة وقد وصلت الفئران بعد الجراحة نقطة زمنية محددة سلفا، إدارة الكيتامين / زيلازين كما وصف أعلاه لرزين.
3. يروي الحيوان intracardially والحصاد الغدة الدرقية / القصبة الهوائية والأنسجة الأخرى ذات الاهتمام (وليس وصفها بالتفصيل هنا).

النتائج

اكتشفنا 19 أورام الغدة الدرقية الغازية من ما مجموعه 20 حقن الفئران بخلايا ATC بعد 4 أسابيع. في المثال هو موضح في الشكل 2A، الفئران تلقي حقنة مثلي من 5X10 ⁵ خلايا ATC نمت في ظل ظروف المرفقة، يحمل تسلل كبيرة من الخلايا السرطانية في الغدة الدرقية بنسبة 4 أسابيع بعد الحقن. تم التحقق من طبيعة غزو الخلايا ATC مع سمة من الخلايا spindled وخلايا متوسطة إلى الحجم العملاق مع الاتهاب السيتوبلازم والنواة كبيرة من قبل الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ. وعلى سبيل المقارنة، يظهر الغدة الدرقية والقصبة الهوائية من مراقبة الحيوانات غير المحقونة في الشكل 2B. بصيلات الحيوان uninjected عرض وثيقة، حتى الآن فضفاض وتكوين الجمعيات ويكون أساسا التشكل الجولة.

ونظرا لصغر حجم الغدة الدرقية، واستخدام أسلوب التسليم عن طريق الحقن، قد تنشأ نتائج غير مقصودة. الشكل 3A يوضحالأكثر شيوعا لاحظ، وهو وضع كتلة الورم خارج، ولكن ليس تشمل، الغدة الدرقية. هذا هو أكثر من المحتمل بسبب اختراق الإبرة من خلال وخارج الغدة الدرقية عندما يتم طرد الخلايا. أحيانا، والفئران مع تقديم أي نمو الورم، سواء بشكل صارخ وتشريحيا، يتم الكشف عنها كما هو مبين في الشكل 3B. يمكن أن يكون سبب غياب التنمية الورم كشفها بواسطة طرد تعليق الخلية من موقع الحقن ونشرها في الأنسجة وتجاويف المجاورة.

الشكل 1. تعريض الغدة الدرقية. تسميات تشير إلى اليمين واليسار الغدد الدرقية المحيطة القصبة الهوائية.

الشكل 2. الفحص النسيجي من نمو الورم وفيكانت vasion بعد نجاح حقن الغدة الدرقية. عينات الأنسجة مقطوع على طول الطائرة الاكليلية. A) الصورة التي اتخذت في 200x من الماوس واظهار نمو الورم كبير مع خلايا spindled مميزة وخلايا متوسطة إلى الحجم العملاق مع الاتهاب السيتوبلازم والنواة كبيرة في الهيماتوكسيلين ويوزين ( H & E) وصمة عار تو يدل على الآفة الأولية التي الخلايا السرطانية غزو الغدة الدرقية B) القصبة الهوائية والغدة الدرقية من مراقبة الحيوانات (الصورة التي اتخذت في 100X) تو، والأورام؛. S، العضلات الملساء؛ TR، القصبة الهوائية؛ خاصتك، الغدة الدرقية.

الشكل 3. وكانت النتائج غير المقصودة للحقن مثلي. عينات الأنسجة مقطوع على طول الطائرة الاكليلية. A) نمو الورم الطرفية مع عدم وجود نمو واضح في thyroiد (السهم الأسود، الصورة التي اتخذت في 100X). ب) عدم الكشف عن الورم على الإجمالي (لا يظهر) أو النسيجية الفحص (الصورة التي اتخذت في 50X). خاصتك، الغدة الدرقية.

Discussion

في نموذجنا، أظهرت الحيوانات الغدة الدرقية ورم خبيث ورم والأمراض المرتبطة الضائقة دنف والجهاز التنفسي بنسبة 4 أسابيع بعد الحقن. كما هو الحال مع معظم النماذج الأخرى مثلي الاستفادة التسليم عن طريق الحقن من تعليق خلية، الحقن في الأنسجة المحيطة بها وبعد الحقن تسرب أن ينتشر ما وراء الهدف ممكنة. مع أن يقال، واحد غير معروف المحتملة التعرف ينتجها هذا الإجراء هو تأثير التعرض الهدف قبالة لالانبثاث أو مضاعفات غير مرض. هذا هو مصدر قلق عام مع معظم عمليات زرع xenographic، بغض النظر عن يجري التحقيق المرض. ومع ذلك، عواقب غير مقصودة من ورم خبيث يمكن التقليل بشكل كبير من خلال ضمان شطبة كامل من طرف الإبرة قد اخترقت الغشاء تتراكب بشكل مريح الغدة الدرقية وطرد ببطء تعليق الخلوية. إذا لوحظ تسرب أثناء أو بعد الحقن، قد يتم حذف تلك الحيوانات من الدراسة.

معشوقة = "jove_content"> ومن الضروري أن الحيوانات و perfused قبل حصادها الغدة الدرقية / القصبة الهوائية والأنسجة الأخرى. يتم الاحتفاظ فوائد هي ذات شقين، 1) يتم إزالة خلايا الدم الحمراء ولن تحدث فوضى في العينات النسيجية و2) مورفولوجيا الأنسجة وسلامة. وعلاوة على ذلك، مستأصل الغدة الدرقية / القصبة الهوائية التي لديها إما كتلة رمي تعلق أو مدفون في داخلها يجب أن تقطع بطريقة المعالم التشريحية يمكن تحديدها قبل أن يتم جزءا لا يتجزأ من لإعداد النسيجية. وهذا سوف يقلل بشكل كبير الوقت اللازم لإعداد العينة.

في هذا التقرير وصفنا النمو المحلي وغزو المتقدمة ورم الغدة الدرقية بعد حقن مثلي من الخلايا ATC. ATC ورم خبيث قد يتم التحقيق من خلال تحليل التحضيرات النسيجية من الأنسجة الأخرى باستخدام البقع النسيجية القياسية، مثل الهيماتوكسيلين ويوزين، أو عن طريق استخدام الخلايا المناعية أو علامات علم الأمراض ذات الصلة. هذا النظام يمكن تطويرها من قبل زتعديل enetically خلايا سرطان الغدة الدرقية مع الصحفيين مضان بحيث التصوير الحي يمكن أن تستخدم لرصد الانبثاث وفعالية من العلاجات العلاجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 cell culture media	Mediatech	10-041-CV	Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0001
Matrigel	Becton, Dickinson and Company	354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"	Roboz	RS-5135
Disposable scalpel, No. 15	Feather	2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated	gSource	gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture	Surgical Specialties Corporation	1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds	Medline	MIINON260101	For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer	Wahl	8655	For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2%	Penn Veterinary Supply	VED1222
Betadine	Henry Schein Company	6906727
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply	Butler Animal Health Supply	6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26"	Busse	696
Drapes (CSR Wrap)	Cardinal Health	AT 21 412
27G ½" needle	Becton, Dickinson and Company	309623
31G 5/16" needle	Becton, Dickinson and Company	328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment