מודל עכבר orthotopic של קרצינומה של בלוטת התריס אנפלסטית

Summary

הדור של מודל עכבר orthotopic של קרצינומה של בלוטת התריס אנפלסטית מתואר כאן. טכניקה זו מעסיקה מיקום כירורגית של תאי סרטן בבלוטת התריס anaplastic אדם לבלוטת התריס של עכברי immunodeficient, ובכך ליצור אווירה יותר רלוונטית מבחינה קלינית ללמוד התקדמות מחלה, כמו גם התערבויות טיפוליות חדשניות מסך.

Abstract

מספר סוגים של מודלים של בעלי חיים של קרצינומה של בלוטת התריס אדם כבר הוקמו, ובכלל זה תת עורי וxenograft השתלת orthotopic של תאים סרטניים לעכברים immunodeficient. המודלים xenograft תת עורי היו יקרים להקרנה והערכה של טיפולים פרה טיפוליים חדשים. ישנם מספר היתרונות לשימוש במודל תת עורית; 1) מהיר, 2) לשחזור, ו3) הקמת גידול, צמיחה, ותגובה לסוכנים טיפוליים עשויים להיות במעקב על ידי בדיקה חזותית. עם זאת, ראיות משמעותיות יש לשפוך אור על בואם קצר של דגמי xenograft תת עורי ^1-3. לדוגמה, טיפולים רפואיים הממחישים תכונות המרפאות במודלי xenograft תת עורי לעתים קרובות אין להם השפעה ניכרת על המחלה האנושית. Microenvironment של האתר של השתלת xenographic או הזרקה טמון בלבו של שוני זה.

מודלים xenograft סרטניים Orthotopic לספק biolo יותרהקשר רלוונטי gically שבו ללמוד את המחלה. היתרונות של השתלת תאים חולים או רקמות למקבילת המקור האנטומי שלהם בתוך חיה מארחת כוללים אתר מתאים לאינטראקציות גידול מארחות, התפתחות של גרורות הקשורים למחלה ואת היכולת לבחון את השפעת האתר ספציפית על תרופות טיפוליות ניסיוניות. לכן, מודלים xenograft orthotopic נמל ערך הרבה יותר קליני כי הם מתרבים מחלה אנושית באופן הדוק. מסיבות אלה, מספר הקבוצות ניצלו את מודל סרטן בלוטת התריס orthotopic ככלי מחקר ^4-7.

כאן, אנו מתארים את הגישה שקובעת מודל orthotopic לחקר סרטן בלוטת התריס אנפלסטית (ATC), שהוא פולשני מאוד, מתנגד לטיפול, וכמעט קטלני בכל החולים שאובחנו. תאים בתרבית ATC ערוכים להשעיה סלולרית מנותקת בתמיסה המכילה מטריצת קרום במרתף. נפח קטן הוא לאט injected לבלוטת התריס הנכונה. מראה כללי ובריאות של העכברים מנוטרים על מנת להבטיח סיבוכים שלאחר ניתוח מינימאליים וכדי לאמוד penetrance פתולוגית של הסרטן. עכברים הם הקריבו ב4 שבועות, ורקמות שנאספו לניתוח היסטולוגית. בעלי חיים עשויים להילקח בזמן מאוחר יותר לבחון את נקודות יותר מראש את התקדמות המחלה. ייצור של מודל עכבר orthotopic זו יוצר פלטפורמה שמשיגה שתי מטרות: 1) עוד יותר את ההבנה שלנו של ATC פתולוגיה, ו2) מסך סוכנים טיפוליים עכשוויים ועתידיים ליעילות במאבק ATC.

Protocol

1. הכנת תא

הערות: 1) מתכון מלא RPMI 1640 מבוסס תרבות תקשורת (500 מ"ל) כולל 435 מ"ל 1640 RPMI, 50 מיליליטר FBS מומת חום, 5 חומצות אמינו לא חיוני מ"ל, פירובט נתרן 5 מ"ל, 5 מיליליטר האנטיביוטיקה antimycotic, 2) מקום matrigel ב 4 ° C יום לפני קציר תא אחד.

1. שורת תאים האנושית ATC-11T THJ ⁸ גדלים ב6 צלחות תרבות היטב ונקטפו ברגע 80-90% ומחוברות.
2. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 4 דקות בטמפרטורת חדר.
3. לשאוב תקשורת ותאי resuspend בתקשורת 1640 RPMI [צלחת גם 2 מ"ל / 6].
4. קח את נפח קטן של ההשעיה התא, להוסיף אותו לכרך אחד של 0.4% trypan כחול צבע ולקבוע צפיפות תאים באמצעות TC10 נגד תא אוטומטי.
5. חישוב נפח של השעיה תא צריכה לקבל 5 פי 10 ⁵ תאים / עכבר x עכברי מספר הזרקה.

הערה: כדי להבטיח שמודעה להשוות את ההשעיה תא להזרקה, להכין תאים כאילו אתה הזרקה כפולה מספר העכברים (למשל, אם הזרקת 5 עכברים, ולאחר מכן להכין את ההשעיה תא כאילו היית הזרקת 10 עכברים).

6. העבר את הנפח דרוש של השעיה תא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
7. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 4 דקות בטמפרטורת חדר.
8. לשאוב תקשורת ותאי resuspend בתקשורת להשלים RPMI 1640.
9. העברת תאי צינור מ"ל 1.6, להוסיף נפח של 1 matrigel ומערבבים בעדינות על ידי pipetting לאט פנימה והחוצה.

הערה: כל עכבר יקבל 10 μl של קוקטייל ההשעיה / matrigel התא. מאז 5 x 10 ⁵ תאים מרחפים בנפח 10 זריקות μl היו בשימוש בהצלחה בלימודי ATC orthotopic ^9-10 הקודמים, השתמשנו בפרמטרים האלה בדוח זה.

10. הנח השעיה תא על קרח עד מוכן לשימוש.

_title "> 2. הכנת עכבר

1. נקה את אזור הניתוח, הכולל את היקף הניתוחים ואזור שמסביב, על ידי ניגוב כל המשטחים עם 70% אתנול.
2. הפעל מנורות חימום / כריות שבו בעלי החיים יהיו מתאוששים מניתוח.
3. לנהל 0.1 מ"ל קטמין / xylazine (קוקטייל תרופות בהיקף של 9 קטמין מ"ג / מ"ל ​​ו xylazine 1mg/ml) לintraperitoneally משקל הגוף גרם 10 באמצעות 1 מ"ל, 27G ½ "מזרק טוברקולין.
4. עכבר הכנה לניתוח: 1) לגלח את אזור צוואר של עכבר (מקו הלסת העליון של עצם חזה ולהחוצה לזרועות), 2) לשפשף אזור ניתוח שלוש פעמים עם ריבועי גזה ספוגים chorhexadine, 3) לשפשף סופי נעשה עם גזה ספוגה בטאדין, 4 ) בעדינות להחיל משחה העין כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
5. בדקו דוושת רפלקס כדי להבטיח עכבר מסומם במידה מספקת.
6. הנח חיה שכיבה על גב מכשול שדה סטרילי הפנוי מתחת למשטח הביתור ולאבטח את החיה במקום עם סרט בד.
7. ידי ו-F פילינגingernails ואז לשים את כפפות כירורגיות סטריליות.
8. בצורה סטרילית, ניתוח פתוח לארוז ולארגן את המכשירים.
9. הנח וילון סטרילי על בעלי חיים, עוזב את האתר ניתוחי בלבד חשוף.

3. גישה ניתוחית לבלוטת התריס והזרקת תאים

1. שימוש סטרילי, אזמל חד פעמי, לעשות חתך אורכי 1 ל 1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הגרון.

הערה: סטייה מקו האמצע עמוק יותר מסבכת חיתוך כדי לגשת לקנה הנשימה. די חתך קו האמצע מדויק מאפשר לך להקניט ולחתוך את הרקמה הקרומית מחזיקה בלוטות רוק ימנית ושמאליות יחד ומפחית את הסיכוי לסחב או ניתוק עורקים גדולים.

2. ביצוע חתך שני לתוך שרירי הרצועה המקיפים את קנה הנשימה ואז למשוך את הצד של השריר חרות הזכות לצד לחשוף את בלוטת התריס הימנית.
3. Hemostats יכול לשמש בשלב זה לקיים את שכבת השרירחלק לגישה קלה לבלוטת התריס (איור 1).

הערה: לחלופין, אם הליך מבוצע על ידי שני אנשי צוות הכירורגי, שכבת השריר ניתן פשוט התאפקה עם מלקחיים תוך מזרק מוכן להזרקה הוא להתמנות למנתח על ידי צוות הסיוע.

4. לאט לאט להזריק 10 μl של השעיה תא לתוך בלוטת התריס הנכונה באמצעות מזרק אינסולין 31G 5/16 "ואז בעדינות להסיר את המחט.

4. סגירתו של אתר כירורגית ושחזור מאוס

1. שכבת שריר תפר עם חומר 6.0 תפירה או באמצעות סגנון תפירה רציף או קטוע.
2. תפר העור באותו אופן.
3. למרוח שכבה של משחה אנטיביוטית משולשת ישירות מעל אתר חתך.
4. אפשר לבעלי חיים כדי לשחזר שכיבה על גב כרית חימום חם. ברגע שבעלי חיים יכולים להשיג עינת חזה ללא סיוע, ניתן למקם אותו בחזרה עם עכברים אחרים.

<כיתת p = "jove_title"> 5. מעקב לאחר ניתוח ואיסוף רקמות

1. בדקו את אתר חתך ועל בריאות כללית של החיה ביום למשך שבוע לאחר ניתוח, ולאחר מכן לבדוק פעם בשבוע. אם התפרים הם עדיין שלמים אחרי 14 ימים, שהם יוסרו.

הערה: בעלי חיים מציגים סימנים של ירידה בבריאות (למשל אובדן משמעותי במשקל, שיער מוזנח, נשימה מאומצת) צריכים להיות מורדמים ורקמות שנאספו.

2. ברגע שעכברים הגיעו לנקודה זמן שלאחר ניתוח שנקבעה מראש, לנהל קטמין / xylazine כמו לתאר לעיל כדי להרדים.
3. Perfuse חיה intracardially וקציר בלוטת התריס / קנה הנשימה וברקמות אחרות של עניין (אינו מתוארת בפירוט כאן).

תוצאות

גילינו 19 גידולים בבלוטת התריס פולשניים מתוך סך של 20 עכברים הוזרקו תאי ATC לאחר 4 שבועות. בדוגמא שמוצגת באיור 2 א, עכברים שקבלו זריקת orthotopic של ⁵ תאי ATC 5x10 גדלו בתנאים מצורפים, תערוכת חדירה משמעותית של תאים סרטניים בבלוטת התריס על ידי 4 שבועות לאחר ההזרקה. אופיים של התאים הפולשים ATC עם תאים אופייניים מוארכים ותאים בינוניים עד ענק בגודל עם eosinophilic ציטופלסמה וגרעינים גדולים אומת על ידי hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים. לשם השוואה, בלוטת התריס וקנה הנשימה מחית שליטה שאינה המוזרקת מוצג באיור 2. זקיקים של החיה uninjected להציג קרובה, עדיין רופפת, ויש לי בעצם עמותת מורפולוגיה סיבוב.

בשל גודלו הקטן של בלוטת התריס ושימוש במשלוח זריקות, תוצאות לא מכוונות שעלולות להתעורר. איור 3 א ממחישציינתי הנפוץ ביותר, שהוא הפיתוח של מסת גידול מחוץ, אבל לא מקיף, בלוטת התריס. זה יותר סביר להניח שעקב חדירת המחט דרך ומעבר לבלוטת התריס כאשר תאים גורשו. לפעמים, עכברים עם הצגה אין צמיחת גידול, הן גסות והיסטולוגיה, מזוהים כפי שמוצגים באיור 3. היעדר התפתחות גידול זיהוי יכול להיגרם על ידי גירוש של ההשעיה התא מאתר ההזרקה וההפצה לרקמות וחללים שכנות.

איור 1. חשיפה של בלוטת התריס. תוויות מצביעות על בלוטת תריס ימין ושמאל משני צדי קנה נשימה.

איור 2. בדיקה היסטולוגית של גידול ובדגימות רקמת vasion לאחר הזרקת בלוטת התריס מוצלחת. נותחו במישור העטרה.) תמונה שצולמה ב200X של עכבר מציג גידול משמעותי בתאים אופייניים מוארכים ותאים בינוניים עד ענק בגודל עם eosinophilic ציטופלסמה וגרעינים גדולים בhematoxylin ו eosin ( H & E) כתם ט"ו מציין את הנגע הראשוני שממנו התאים סרטניים לפלוש לבלוטת התריס ב ') קנה נשימה ובלוטת תריס מבעלי החיים שליטה (תמונה נלקחה ב100X) ט"ו, גידולים;... S, שריר חלק; Tr, קנה נשימה; Thy, בלוטת תריס.

איור 3. תוצאות לא מכוונות של הזרקת orthotopic. דגימות רקמה נותחו במישור העטרה. גידול היקפי) ללא צמיחה ניכרה בthyroiחוסר גילוי גידול על ברוטו (לא מוצג) או בדיקה היסטולוגית ד (חץ שחור, תמונה שצולמה ב100X). ב) (תמונה צולמה ב50X). Thy, בלוטת תריס.

Discussion

במודל שלנו, בעלי החיים הדגימו גרורות בלוטת התריס גידולים ומחלות הקשורות מצוקה ותשישות כרונית בדרכי הנשימה על ידי 4 שבועות לאחר ההזרקה. כמו ברוב הדגמים אחרים orthotopic ניצול מסירת זריקות של השעיה תא, זריקה לתוך רקמות הסובבות וזליגה לאחר ההזרקה שמתפשטת מעבר ליעד אפשרי. עם זאת נאמר, לא ידוע אחד לזיהוי פוטנציאל המיוצר על ידי הליך זה הוא ההשפעה של חשיפה ליעד את גרורות שאינן קשורות למחלה או לסיבוכים. זוהי דאגה כללית עם רוב השתלות xenographic, ללא קשר למחלה נחקרת. עם זאת, השלכות לא מכוונות מגרורות עשויים להיות ממוזערת באופן משמעותי על ידי הבטחת כל השיפוע של קצה המחט חדרה את הקרום בנוחות כיסה את בלוטת התריס וגירוש ההשעיה הסלולרית לאט. אם דליפה הוא ציין במהלך או לאחר ההזרקה, בעלי החיים אלה עשויים להיות מושמטים מהמחקר.

ילדה = "jove_content"> זה חיוני כי בעלי החיים הם perfused לפני קצירת בלוטת התריס / קנה הנשימה וברקמות אחרות. היתרונות הם כפול, 1) תאי דם אדומים הם מטוהרים ולא יפריעו לי דגימות היסטולוגית ו -2) מורפולוגיה רקמות ויושרה נשמרות. יתר על כן, בלוטת התריס / קנה נשימה שיש לי resected או מסת tumorous המצורפת או קבור בתוכו יש לחתוך בצורה שניתן לזהות אתרים אנטומיים לפני שמוטבעים להכנה היסטולוגית. זה יפחית את הזמן באופן דרמטי הכנת דגימה.

בדו"ח זה אנו מתארים צמיחה מקומית ופלישה של גידול בבלוטת תריס מתקדם בעקבות הזרקת תאי orthotopic של ATC. ATC גרורות עשויות להיחקר על ידי ניתוח הכנות היסטולוגית של רקמות אחרות באמצעות כתמים היסטולוגית סטנדרטיים, כגון hematoxylin ו eosin, או על ידי ניצול אימונוהיסטוכימיה תא או סמנים רלוונטיים פתולוגיה. מערכת זו יכולה להיות מפותחת יותר על ידי Genetically שינוי תאי סרטן בבלוטת התריס עם כתבי הקרינה כך שהדמית חיה ניתן להשתמש כדי לפקח על גרורות ואת היעילות של טיפולים רפואיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 cell culture media	Mediatech	10-041-CV	Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0001
Matrigel	Becton, Dickinson and Company	354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"	Roboz	RS-5135
Disposable scalpel, No. 15	Feather	2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated	gSource	gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture	Surgical Specialties Corporation	1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds	Medline	MIINON260101	For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer	Wahl	8655	For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2%	Penn Veterinary Supply	VED1222
Betadine	Henry Schein Company	6906727
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply	Butler Animal Health Supply	6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26"	Busse	696
Drapes (CSR Wrap)	Cardinal Health	AT 21 412
27G ½" needle	Becton, Dickinson and Company	309623
31G 5/16" needle	Becton, Dickinson and Company	328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment