Ортотопическая мышиной модели рака щитовидной железы Анапластический

Резюме

Генерация ортотопический мышиной модели рака щитовидной железы анапластическую описан здесь. Эта техника используется хирургическое помещение человека анапластическую клетки рака щитовидной железы в щитовидную иммунодефицитных мышей, создавая тем самым более клинически значимых настройки для изучения прогрессирования заболевания, а также экран инновационных терапевтических вмешательств.

Аннотация

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models^1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.

Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool^4-7.

Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

протокол

1. Подготовка клеток

Примечания: 1) в комплекте RPMI 1640 питательных сред на основе рецептов (500 мл) содержит 435 мл RPMI 1640, 50 мл инактивированной нагреванием FBS, 5 мл несущественные аминокислоты, 5 мл пирувата натрия, 5 мл противогрибковым антибиотикам, 2) место матригель при 4 ° С за один день до сбора клеток.

1. УВД человека клеточной линии THJ-11T ⁸ выращивают в 6-луночные планшеты культуры и собирали один раз 80-90% сливной.
2. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
3. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в среде RPMI 1640, [2 мл / 6 лунками].
4. Возьмите небольшой объем клеточной суспензии, добавить его к одному объему 0,4% трипанового синего красителя и определить плотность клеток TC10 использованием автоматического счетчика Cell.
5. Рассчитать объем клеточной суспензии, необходимые для получения 5 х 10 ⁵ клеток / мышь раза число мышей инъекцией.

Примечание: Для обеспечения объявление приравнять клеточной суспензии для инъекций, подготовить клетки, как будто вы инъекционных двойных количество мышей (например, если инъекционных 5 мышей, а затем подготовить клеточной суспензии, как будто вы были потребителями инъекционных 10 мышей).

6. Передача необходимый объем клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
7. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Аспирируйте СМИ и ресуспендируйте клеток в полной RPMI 1640.
9. Передача клетки 1,6 мл пробирку, добавляют 1 объем матригель и аккуратно, медленно пипетки и выход.

Примечание: Каждая мышь получит 10 мкл клеточной суспензии / Матригель коктейль. С 5 х 10 ⁵ клеток приостановлены в 10 мкл объема инъекций успешно использовались в предыдущих исследованиях УВД ортотопический ^9-10, мы использовали те параметры, в настоящем докладе.

10. Место для клеточной суспензии на льду до использования.

_title "> 2. Подготовка Мышь

1. Очистите хирургической зоны, включающей рассекает сферу и его окрестностях, путем протирания всех поверхностей с 70% этанола.
2. Включите нагревательные лампы / колодки, где животные будут восстанавливается после операции.
3. Администрирование 0,1 мл кетамина / ксилазина (препарат коктейль, состоящий кетамина 9 мг / мл и ксилазина 1mg/ml) в расчете на 10 г массы тела внутрибрюшинно с использованием 1 мл, 27G ½ "туберкулин шприца.
4. Подготовка к операции мыши: 1) брить шею область мышиного (от линии челюсти верхней части грудины и к оружию), 2) скраб хирургической области три раза chorhexadine пропитанной марли квадратов, 3) окончательное скраб сделано бетадином пропитанной марли, 4 ) осторожно применять глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз.
5. Проверьте педаль рефлекс для обеспечения адекватного мышь седации.
6. Поместите животное в спинных лежачее положение одноразовый стерильный барьер поля под рассекает сферу и защитить животных в месте с тканевой лентой.
7. Scrubs рук и ногingernails затем надеть стерильные хирургические перчатки.
8. В стерильных моды, открытой хирургии упаковать и расставляем орудия.
9. Наведите стерильная салфетка над животными, оставив только хирургическое сайте подвергаются.

3. Хирургический доступ к щитовидной железы и инъекции клеток

1. Используя стерильный, одноразовый скальпель, сделать 1-к-1,5 см продольный разрез вдоль средней линии горла.

Примечание: Отклонение от средней линии глубокой резки усложняет доступ к трахее. Довольно точное срединный разрез позволяет дразнить и прорезать мембранной ткани удерживая левую и правую слюнных желез вместе и уменьшает шанс никующих или отделение крупных артерий.

2. Сделать второй разрез в ремень мышцы, окружающие трахею затем вытащить правой стороны надрезанные мышц в сторону, чтобы подвергать правой щитовидной железы.
3. Hemostats можно использовать в этот момент провести мышечного слоячасти для легкого доступа к щитовидной железе (рис. 1).

Примечание: Кроме того, если процедура выполняется двумя хирургического персонала, мышечный слой может быть просто сдерживали щипцами в то время как готовые инъекционные шприцы и вручается хирург вспомогательного персонала.

4. Медленно введите 10 мкл клеточной суспензии в правую щитовидной железы использованием 31G 5/16 "инсулиновый шприц Затем аккуратно удалить иглу.

4. Закрытие операционного и мышь восстановления

1. Шовный мышечный слой с 6,0 сшивания материала с использованием непрерывной или прерванный наложения швов стиля.
2. Стежка кожи таким же образом.
3. Нанесите слой тройной антибиотик мазь непосредственно на месте разреза.
4. Разрешить животного восстанавливаться в спинных лежачее положение теплую грелку. Как только животное может достичь грудины лежачее положение без посторонней помощи, он может быть помещен обратно с другими мышами.

<р = класса "jove_title"> 5. Послеоперационный мониторинга и сбора ткани

1. Проверить сайт разрез и общее состояние здоровья животного ежедневно в течение недели после операции, а затем проверить раз в неделю. Если швы остаются нетронутыми после 14 дней, они удаляются.

Примечание: Животные, демонстрирующие признаки ухудшения здоровья (например, значительная потеря веса, потрепанными волосами, затрудненное дыхание) следует усыплять и тканей собраны.

2. Как только мыши достигли заданной послеоперационный момент времени, управлять кетамин / ксилазина, как описано выше успокоить.
3. Заливать животных внутрисердечно и урожай щитовидной железы / трахеи и других тканей интереса (подробно не описаны здесь).

Результаты

Мы обнаружили 19 инвазивных опухолей щитовидной железы в общей сложности 20 мышей, которым инъецировали клетки ATC после 4 недель. В примере, показанном на фиг.2А, мышей, получавших ортотопической инъекции 5X10 ⁵ клеток АТС, выращенных в прилагаемой условиях, проявляют значительную инфильтрацию раковых клеток в щитовидной железе на 4 недели после инъекции. Характер вторжения в клетки ATC с характерной веретенообразной клетки и средне-и гигантского размера клеток с эозинофильной цитоплазмой и большие ядра была проверена гематоксилином и эозином (H & E) окрашивания. Для сравнения, щитовидной железы и трахеи из неинъекционные контрольное животное показано на рисунке 2B. Фолликулы uninjected животных отображать близко, но свободные, ассоциации и имеют, по существу круглой морфологии.

Из-за небольшого размера щитовидной железы и использование инъекционного доставки, непреднамеренные результаты могут возникнуть. Фиг.3А иллюстрируетНаиболее часто наблюдается, что развитие опухолевой массы за пределами, но не охватывает, щитовидной железы. Это больше, чем, вероятно, из-за проникновения иглы, и в других щитовидной железы, когда клетки изгнаны. Иногда мышей представления, не рост опухоли, как грубо и гистологически обнаруживаются как показано на фиг.3В. Отсутствие определяемых развитием опухоли может быть вызвано изгнанием клеточную суспензию из места инъекции и распространение на соседние ткани и полостей.

Рисунок 1. Разоблачение щитовидной железы. Этикетки указывают на правой и левой щитовидной железы, фланкирующие трахеи.

Рисунок 2. Гистологическое исследование роста опухоли и вОбразцы vasion после успешной инъекции щитовидной железы. ткани рассекают вдоль фронтальной плоскости.) изображения, снятого при 200X мыши выставке существенного роста опухоли с характерной веретенообразной клетки и средних до гигантских размеров клеток с эозинофильной цитоплазмой и крупными ядрами в гематоксилином и эозином ( H & E) пятно Ту указывает на первичное поражение от которых опухолевые клетки проникают в щитовидной B) трахеи и щитовидной железы от контрольных животных (изображения, снятого при 100X) Ту, опухоли;... S, гладкие мышцы; Тр, трахеи; Твоего, щитовидной железы.

Рисунок 3. Непреднамеренных результатов ортотопический инъекции. Образцы тканей рассекают вдоль фронтальной плоскости.) Периферийное роста опухоли, не проявляется в росте thyroiD (черная стрелка, изображения, снятого при 100х). B) Отсутствие обнаружение опухоли на брутто (не показано) или гистологического исследования (изображения, снятого при 50х). Твоей, щитовидной железы.

Обсуждение

В нашей модели, животные продемонстрировали щитовидной железы метастазы опухоли и заболевания, связанного кахексии и дыхательной недостаточности на 4 недели после инъекции. Как и большинство других ортотопической модели использования инъекций доставки клеточной суспензии, инъекции в окружающие ткани и после инъекции утечки, которая распространяется за пределы целевого возможно. С этим, как говорится, один узнаваемый потенциал неизвестного производства этой процедуры является эффект от воздействия цели, не связанные с заболеванием метастазов или осложнений. Это общее беспокойство с большинством ксенографического трансплантации, независимо от изучаемой болезни. Тем не менее, непреднамеренных последствий от метастаз может быть значительно минимизированы путем обеспечения всей конической кончика иглы проникла мембраны плотно наложения щитовидной железы и медленно изгнания клеточной суспензии. Если утечка наблюдается во время или после инъекции, эти животные могут быть опущены из исследования.

Важно, что животные перфузии до сбора щитовидной железы / трахеи и других тканей. Преимущества в два раза, 1) эритроциты удаляются и не будут загромождать гистологических препаратов и 2) морфологию ткани и целостности сохраняется. Кроме того, резекция щитовидной железы / трахеи, которые либо опухолевого массу, прикрепленную или похоронены в нем должны быть обрезаны таким образом, что анатомические ориентиры могут быть определены прежде, чем быть встроенные для гистологического препарата. Это позволит резко сократить время подготовки образца.

В данном докладе рассматривается локальный рост и инвазия опухоли передовых щитовидной ортотопический после инъекции клеток УВД. ATC метастазы могут быть исследованы путем анализа гистологических препаратов других тканей с использованием стандартных гистологических красителей, таких как гематоксилином и эозином, или с помощью иммуногистохимии использованием клеток или патологии соответствующих маркеров. Эта система может быть дальнейшее развитие гenetically изменения клетки рака щитовидной железы с флуоресцентным журналистам, так что живого изображения может быть использован для мониторинга метастазов и эффективности терапевтических процедур.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 cell culture media	Mediatech	10-041-CV	Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0001
Matrigel	Becton, Dickinson and Company	354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"	Roboz	RS-5135
Disposable scalpel, No. 15	Feather	2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated	gSource	gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture	Surgical Specialties Corporation	1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds	Medline	MIINON260101	For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer	Wahl	8655	For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2%	Penn Veterinary Supply	VED1222
Betadine	Henry Schein Company	6906727
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply	Butler Animal Health Supply	6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26"	Busse	696
Drapes (CSR Wrap)	Cardinal Health	AT 21 412
27G ½" needle	Becton, Dickinson and Company	309623
31G 5/16" needle	Becton, Dickinson and Company	328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment