Anaplastik Tiroid Kanseri Ortotopik Fare Modeli

Özet

Anaplastik tiroid kanseri ortotopik fare modeli Üretimi burada açıklanmıştır. Bu teknik böylece hastalığın ilerlemesi hem de ekran yenilikçi tedavi yaklaşımları incelemek için daha klinik ortam yaratan, bağışık yetmezliği olan farelerin tiroid, insan anaplastik tiroid kanser hücrelerinin cerrahi yerleştirme kullanır.

Özet

Insan tiroid kanserlerinin hayvan modellerinde çeşitli deri altı ksenogreft ve bağışık yetmezliği olan farelere kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonu da dahil olmak üzere, kurulmuştur. Cilt altı ksenogreft modelleri klinik öncesi tarama ve yeni tedavi tedavilerin değerlendirilmesi için değerli olmuştur. Deri altı bir modelini kullanarak bir çok avantaj bulunmaktadır: 1), hızlı, 2), yeniden üretilebilir, ve 3) tümör kurulması, büyüme ve terapötik ajanlara yanıt görsel muayene ile izlenebilir. Ancak, önemli kanıtlar ^1-3 deri altı ksenogreft modellerinin kısa geliş ışık tutmuştur. Örneğin, deri altı ksenograft modellerinde tedavi edici özellikleri gösteren tıbbi tedaviler genellikle, insan hastalığı üzerinde kayda değer bir etkisi vardır. Xenographic nakli veya enjeksiyon sitenin mikro bu farklılık kalbinde yer alır.

Ortotopik tümör xenograft modelleri daha biolo sağlamakHastalığın incelemek için gically ilgili bağlam. Bir dizi hayvan içindeki anatomik kökenli eşdeğer içine hastalıklı hücre veya doku implante avantajları uygun bir tümör-konak etkileşimleri için site, hastalıkla ilgili metastaz geliştirme ve araştırma tedavi ilaçları üzerinde siteye özgü etkisini incelemek için yeteneğini de içerir. Onlar yakın insan hastalığı yeniden nedenle, ortotopik ksenogreft modelleri çok daha fazla klinik değeri liman. Bu nedenlerle, gruplar bir dizi bir araştırma aracı ^4-7 olarak ortotopik tiroid kanseri modeli yararlanmaktadır.

Burada, biz, son derece invaziv anaplastik tiroid kanseri (ATC), çalışma için bir ortotopik modeli kurar tedavi direnir ve tüm tanısı alan hastalarda neredeyse ölümcül bir yaklaşım açıklar. Kültürlü hücreler, ATC taban membran matrisi içeren bir çözelti içinde bir ayrışmış hücresel süspansiyon olarak hazırlanır. Küçük bir hacim yavaş yavaş inj olansağ tiroid bezine ected. Farelerin genel görünüm ve sağlık minimal postoperatif komplikasyonlar sağlamak ve kanser patolojik penetranslı ölçmek için izlenir. Fareler 4 hafta sonra kurban edilir ve doku histolojik analiz için toplanır. Hayvanlar hastalığın daha ileri ilerleme incelemek için daha sonra-noktalarında alınabilir. Bizim ATC patoloji anlayış ve etkinliği için 2) ekran mevcut ve gelecekteki terapötik ajanlar ATC mücadelede daha 1): Bu ortotopik fare modeli üretimi iki amacı gerçekleştirir bir platform kurar.

Protokol

1. Hücre Hazırlanması

Notlar:, 2) bir yer Matrigel 1) tam RPMI 1640 kültür ortamı tabanlı tarifi (500 mi) 435 ml RPMI 1640, 50 mi ısı ile deaktive edilmiş FBS, 5 ml esansiyel olmayan amino asitler, sodyum piruvat 5 mi, 5 ml antibiyotik antimikotik içerir 4 ° C hücre hasat öncesinde bir gün.

1. İnsan ATC hücre hattı THJ-11T ⁸ 6 kuyu kültür plakaları yetişen ve% 80-90 birleşik bir kez hasat edilir.
2. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile topak hücrelere.
3. RPMI 1640 medya [2 ml / 6 plaka] medya ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
4. % 0.4 tripan mavi boya, bir hacim eklemek ve TC10 Otomatik Hücre Sayaç kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemek için, hücre süspansiyonu, küçük bir hacme al.
5. Enjekte 5 x 10 ⁵ hücre / fare kat daha fareler elde etmek için gerekli hücre süspansiyonu hacmi hesaplayın.

Not: ad sağlamak için Eğer farelerin çift sayısı (örneğin 5 farelere enjekte eğer 10 farelere enjekte sanki, daha sonra hücre süspansiyonu hazırlamak) enjekte edilir sanki enjeksiyon için hücre süspansiyonu eşit, hücreleri hazırlamak.

6. 15 ml konik bir tüp içine hücre süspansiyonu gerekli hacmi aktarın.
7. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile topak hücrelere.
8. Tam RPMI 1640 medya medya ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
9. 1.6 ml tüp hücreleri aktarın, matrigel 1 hacim ekleyin ve yavaşça pipetleme ve dışarı ile hafifçe karıştırın.

Not: Her fare hücre süspansiyonu / matrigel kokteyl 10 ul alacaksınız. 10 ul enjekte hacmi asılı 5 x 10 ⁵ hücre başarıyla önceki ATC ortotopik çalışmalarda ^9-10 kullanılmıştır bu yana, bu raporda bu parametreler kullanılır.

10. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu yerleştirin.

Yurt İçi "> 2. Fare Hazırlama

1. % 70 etanol ile tüm yüzeyleri silerek diseksiyon kapsamı ve çevresi, içeren cerrahi bölge, temizleyin.
2. Hayvanlar ameliyat sonrası iyileşme olacak ısıtma lambaları / pedleri açın.
3. 1 ml, 27G ½ "Tüberkülin şırınga kullanarak 10 g vücut ağırlığı intraperitoneal başına 0.1 ml ketamin / ksilazin (ketamin 9 mg / ml ve ksilizin 1mg/ml oluşan ilaç kokteyli) yönetmek.
4. Cerrahi Hazırlık fare: 1) betadin batırılmış gazlı bez, 4 ile yapılan son fırçalayın) chorhexadine batırılmış gazlı bez kareler, 3 ile cerrahi alan üç kez fırçalayın fare boyun bölgesi (çene çizgisinden sternum ve silah dışarı başına), 2) tıraş ) hafifçe kurumasını gözleri önlemek için göz merhemi uygulanır.
5. Fare yeterli sedasyon sağlamak için refleks pedal kontrol edin.
6. Diseksiyon kapsamında tek kullanımlık steril alana bariyer üzerinde sırt yatma hayvan yerleştirin ve bez bant ile yerde hayvan sabitleyin.
7. Scrubs Eller ve ayaklaringernails sonra steril cerrahi eldiven koymak.
8. Steril bir şekilde, açık cerrahi paketi ve aletleri düzenlemek.
9. Sadece cerrahi alan maruz bırakarak, hayvan üzerinde steril örtüyü yerleştirin.

3. Tiroid ve Hücre Enjeksiyon için cerrahi Erişim

1. Steril, tek kullanımlık neşter kullanarak, boğazın orta hat boyunca bir 1-to-1.5 cm boyuna kesi yapmak.

Not: orta hat sapma trakea erişmek için daha derin kesme zorlaştırmaktadır. Oldukça hassas orta hat kesi birlikte sağ ve sol tükürük bezleri tutan membranöz doku ile alay ve kesmek için izin verir ve büyük arterler nicklemek veya kesilmesinin şansı azaltır.

2. Trakea çevreleyen kayış kas içine ikinci bir kesi yapmak sonra sağ tiroid bezi ortaya çıkarmak için yan kesik kas sağ tarafında çekin.
3. Hemostat bir kas tabakası tutmak için bu noktada kullanılabilirTiroid bezinin kolay erişim (Şekil 1) için parça.

Not: prosedürü iki cerrahi personel tarafından gerçekleştirilen, bir hazır enjektabl şırınga yardımcı personeli tarafından cerrah teslim ederken Alternatif olarak, kas tabakası sadece forseps ile geri tutulabilir.

4. Yavaş yavaş yavaşça iğne kaldırmak için, 31G 5/16 "insülin şırınga kullanarak sağ tiroid bezi içine hücre süspansiyonu 10 ul enjekte.

4. Cerrahi Site ve Fare Kurtarma kapatılması

1. Ya sürekli ya da kesik kesik dikiş stili kullanarak 6.0 dikiş materyali ile dikiş kas tabakası.
2. Aynı şekilde dikiş cilt.
3. Doğrudan kesi sitesi üzerinden üçlü antibiyotik merhem tabakası uygulayın.
4. Sıcak ısıtma yastığı sırt yatma kurtarmak için hayvan izin verin. Hayvan yardım almadan sternum yatma elde edilebilir sonra, bu diğer farenin sırt ile yerleştirilebilir.

5. Ameliyat sonrası İzleme ve Doku Koleksiyon

1. Cerrahi sonrası bir hafta boyunca her gün kesi ve hayvanın genel sağlık kontrol edin ve ardından haftada bir kontrol edin. Dikişler 14 gün sonra hala bozulmamış ise, bunlar kaldırılır.

Not: azalan sağlık (örneğin önemli kilo kaybı, dağınık saç, nefes darlığı) belirtileri gösteren Hayvanlar ötenazi olmalı ve dokuların topladı.

2. Bir kez fareler ksilizin / ketamin oturaklı için yukarıda tarif olarak yönetmek, önceden belirlenmiş bir ameliyat sonrası zaman noktası ulaşmıştır.
3. Intrakardiyak hayvan serpmek ve hasat tiroid / trakea ve ilgi diğer dokuları (burada ayrıntılı olarak açıklanmayan).

Sonuçlar

4 hafta sonra ATC hücreleri enjekte farenin 20 bir toplam 19 invaziv tiroid tümörleri tespit edildi. Şekil 2A'da gösterilen örnekte, ekli koşullar altında yetiştirilen 5X10 ⁵ ATC hücre ortotopik enjeksiyon alan farenin, 4 hafta sonrası enjeksiyon içine tiroid kanseri hücrelerinin önemli infiltrasyonu gösterirler. Eozinofilik sitoplazma ve büyük çekirdeklere sahip karakteristik bir spindled hücreleri ve orta-boyutlu dev hücreler ile işgal ATC hücrelerin yapısı hematoksilin ve eozin (H & E) boyama ile doğrulandı. Karşılaştırma için, enjeksiyon yapılmamış kontrol hayvan tiroid ve trakea, Şekil 2B'de gösterilmiştir. Uninjected hayvan köklerinin yakın, ama gevşek, dernek görüntülemek ve aslında bir yuvarlak morfoloji var.

Enjektabl teslim tiroid ve kullanım küçük boyutu nedeniyle, istenmeyen sonuçlar ortaya çıkabilir. Şekil 3A göstermektedirEn yaygın olarak gözlemlenen, bunun dışında, bir tümör kitlesi gelişmedir, ancak, tiroid kapsayan değildir. Hücreleri sınırdışı zaman bu ile ve tiroid ötesinde iğne penetrasyon olasılığı daha kaynaklanmaktadır. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, zaman zaman, tümör büyümesi ile kendini gösteren fareler, her iki ağır ve histolojik olarak tespit edilir. Tespit tümör gelişme olmaması komşu doku ve boşluklar içine enjeksiyon yeri ve yayılması gelen hücre süspansiyonu sınırdışı neden olabilir.

Şekil 1. Tiroid açığa. Etiketler trakea yan sağ ve sol tiroid bezleri gösterir.

Şekil 2. Tümör büyümesinin ve histolojik incelemesiBaşarılı tiroid enjeksiyon sonrası vasion. Doku örnekleri koronal düzlemi boyunca kesitler alındı. eozinofilik sitoplazmalı ve HE büyük çekirdekleri (ile karakteristik iğsi hücreli ve orta-dev boyutlu hücreleri ile önemli tümör büyümesi sergileyen fare 200X alınan A) Görüntü H & E) leke Tu tümör hücreleri tiroid istila hangi birincil lezyon gösterir B) Trakea ve kontrol hayvan tiroid (100X alınan görüntü) Tu, Tümörler,... S, düz kas, Tr, trakea, Thy, tiroid bezi.

Şekil 3,. Ortotopik enjeksiyon kasıtsız sonuçları. Doku örnekleri koronal düzlemi boyunca kesitler alındı. A) Periferik tümör büyümesi thyroi belirgin bir büyüme iled (siyah ok, 100X alınan görüntü). B) brüt üzerine tümör tespit eksikliği (gösterilmemiştir) veya histolojik inceleme (50X alınan görüntü). Thy, tiroid bezi.

Tartışmalar

Bizim modelde, hayvanlar 4 hafta sonrası enjeksiyon yoluyla kaşeksi ve solunum sıkıntısı ile ilgili tiroid tümör metastazı ve hastalık gösterdi. Diğer birçok ortotopik modellerinde hedef dışına yayılır çevreleyen doku ve enjeksiyon sonrası kaçak bir hücre süspansiyonu enjekte teslimat, enjeksiyon kullanan ile de mümkündür. Bu söyleniyor, bu işlem ile üretilen bir tanınabilir potansiyel bilinmeyen olmayan hastalığı ile ilgili metastaz veya komplikasyonlara kapalı hedef maruz kalma etkisidir. Bu durum, hastalığın araştırılmaktadır, çoğu xenographic nakli ile genel bir husustur. Bununla birlikte, metastaz gelen kasıtsız sonuçları önemli ölçüde rahatça tiroid bezi kaplayan zarın nüfuz iğne ucu, tüm konik sağlanması ve yavaş yavaş hücresel süspansiyon atarak en aza indirilebilir. Sızıntı enjeksiyon sırasında ya da sonrasında gözlenirse, bu hayvanlar çalışma atlanabilir.

Bu hayvanlar tiroid / trakea ve diğer dokuları önce perfüze esastır. Yararları) iki kat, 1 olan kırmızı kan hücreleri) temizlenir ve histolojik örnekleri ve 2 karmakarışık olmaz doku morfolojisi ve bütünlüğü korunur. Ayrıca, rezeke tiroid / trakea bağlı ya bir tümöral kitle ya da anatomik histolojik hazırlanması için gömülü önce tespit edilebilir bir şekilde kesilmelidir içinde entombed olduğunu. Bu önemli ölçüde numune hazırlama süresini azaltır.

Bu yazıda ATC hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu takiben gelişmiş tiroid tümörün lokal büyüme ve invazyon açıklar. ATC metastaz gibi hematoksilen ve eozin gibi standart histolojik lekeleri, kullanan diğer dokuların histolojik hazırlıkları analiz ederek, ya da immünhistokimya hücre veya patoloji ilgili işaretleri kullanılarak incelenmiştir olabilir. Bu sistem daha g tarafından geliştirilebilircanlı görüntüleme metastaz ve tedavi tedavilerin etkinliğini izlemek için kullanılabilir, böylece enetically floresan gazetecilere tiroid kanser hücrelerini değiştirerek.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 cell culture media	Mediatech	10-041-CV	Media and additives used depend on cell line
TC10 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0001
Matrigel	Becton, Dickinson and Company	354234
Graefe Forceps, Serrated; Slight Curve, 4"	Roboz	RS-5135
Disposable scalpel, No. 15	Feather	2975#15
Olsen Hegar Needle Holder - 4 ½" delicate serrated	gSource	gS 21.5400
6-0 nylon black monofilament suture	Surgical Specialties Corporation	1279B
Heating Pad, reusable, 8" x 12"
Cloth tape, 1" X 10 yds	Medline	MIINON260101	For restraining anesthetized mouse
Peanut Clipper/Trimmer	Wahl	8655	For removing hair from surgical site
ChlorHex-Q SCRUB 2%	Penn Veterinary Supply	VED1222
Betadine	Henry Schein Company	6906727
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
2 x 2 gauze, 12-ply	Butler Animal Health Supply	6936
Sterile Field, Barrier, 18" x 26"	Busse	696
Drapes (CSR Wrap)	Cardinal Health	AT 21 412
27G ½" needle	Becton, Dickinson and Company	309623
31G 5/16" needle	Becton, Dickinson and Company	328438
Ketamine (9 mg/ml) / xylazine (1 mg/ml) solution
Triple antibiotic ointment