الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

Summary

نقدم طريقة الفحص السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي باستخدام عالية الإنتاجية transfections الروبوتية ومحلية الصنع مزدوج توهج luciferase الفحص. هذا البروتوكول يولد بسرعة البيانات المباشرة وظيفية جنبا إلى جنب منذ آلاف الجينات وقابل للتعديل بسهولة لاستهداف أي الجينات في المصالح.

Abstract

نقدم بروتوكول الفرز الفائق الإنتاجية السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي ألفا synuclein، جين يرتبط مرض باركنسون. و transfected الخلايا 293T عابر مع البلازميدات من مكتبة التعبير ORF المحتشدة، جنبا إلى جنب مع البلازميدات مراسل luciferase، في شكل صفيحة ميكروسكوبية-جين واحد لكل جيدا. ويعاير يراعة luciferase النشاط بعد 48 ساعة لتحديد الآثار المترتبة على كل الجينات مكتبة على النسخ ألفا synuclein، تطبيع في التعبير من بناء الرقابة الداخلية (مروج HCMV توجيه Renilla luciferase المراسل). ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل الروبوت مقعد بين كبار المغلقة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، الذي يؤدي التعامل مع السائل العقيم في شكل 96 جيدا. لدينا بروتوكول ترنسفكأيشن الآلي هو قابلية للتكيف مع الإنتاجية العالية الإنتاج المكتبة lentiviral أو غيرها من بروتوكولات الفحص وظيفية تتطلب transfections من ثلاث أعداد كبيرة من البلازميدات مكتبة فريدة من نوعها في conjunction مع مجموعة مشتركة من البلازميدات المساعد. كما نقدم بديل رخيص الثمن وإجازة المتاحة تجاريا، مزدوج الكواشف luciferase المراسل الذي يعمل PTC124، EDTA، وبيروفسفات لقمع النشاط يراعة luciferase قبل قياس Renilla luciferase المراسل. باستخدام هذه الأساليب، ونحن فحص 7،670 الجينات البشرية، وحددت 68 من المنظمين ألفا synuclein. هذا البروتوكول هو قابل للتعديل بسهولة لاستهداف الجينات الأخرى ذات الاهتمام.

Introduction

القدرة على تحديد العناصر التنظيمية الوراثية الرئيسية والعوامل التي تعمل عليها أمر أساسي لاستكشاف العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك، وتحديد العوامل التي تنظم التعبير عن الجينات في أنواع الخلايا نادرة، مثل السكان العصبية محددة، يمكن أن يكون تحديا. هنا، نقدم بروتوكول لتحديد المنظمين النسخي رواية ألفا synuclein (SNCA)، جين يرتبط مرض باركنسون وأعرب في الخلايا العصبية الدوبامين في substantianigra بارس المنطقة المكتنزة من الدماغ المتوسط. علينا أن ننجز هذا باستخدام عالية الإنتاجية، ثنائي luciferase المراسل، في المختبر شاشة مراسل لتفكيك ألفا synuclein التعبير في الخلايا 293T. يتم استنساخ المروج ألفا synuclein لأول مرة في البلازميد مراسل تحتوي على الجين يراعة luciferase. A البلازميد المتاحة تجاريا تحتوي على luciferase المراسل Renilla تحت سيطرة المروج النشط جوهري بمثابة الرقابة الداخلية. تساويبني مراسل ه شارك transfected-293T إلى خلايا في microplates مع البلازميدات من مكتبة الحمض النووي التعبير، مثل أن كل بئر يتم transfected مع البلازميد مكتبة واحدة. بعد 48 ساعة يتم قياس، luciferase النشاط لكل مراسل بالتتابع باستخدام الفحص المزدوج توهج. يستدل التعبير النسبية ألفا synuclein ردا على كل الجينات المكتبة عن طريق نسبة من يراعة: Renilla luciferase النشاط في كل بئر (F: نسبة R) بعد التطبيع القائم على طبق من ذهب.

يوفر هذا البروتوكول القدرة على فحص عدد كبير من الجينات (~ 2،500 في الأسبوع) لقدرتها على transactivate الجين مراسل باستخدام الحد الأدنى من القوة العاملة (1-2 أشخاص) والحد الأدنى من التكلفة (حوالي 3 دولار تكلفة كاشف لكل صفيحة ميكروسكوبية مقايسة). المنظمين النسخي الجينات العصبية (على سبيل المثال، ألفا synuclein)، والتي هي صعبة للدراسة في الخلايا العصبية مثقف الحرارية للتلاعب الجيني، يمكن مقارنة جنبا إلى جنب في هذا الاختبار وظيفية مباشرة. ندرج في منطقتنابروتوكول طريقة مفصلة لالاستنساخ ونمو البلازميدات تحتوي على مروج ألفا synuclein، منذ وجدنا أن البلازميدات تحتوي على هذه المنطقة غير مستقرة عندما نمت مع الإجراءات التقليدية (انظر المناقشة). نحن تشمل أيضا بديل غير مكلفة لمتاحة تجاريا الكواشف المزدوجة luciferase المراسل لفحوصات عالية الإنتاجية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف العناصر التنظيمية الأخرى ذات الاهتمام، أو إلى أي عملية تتطلب الإنتاجية العالية transfections عابرة.

Protocol

لمحة عامة التجريبية، انظر الشكل 1.

1. إعداد البلازميدات مراسل احتواء ألفا Synuclein المروج

العناصر التنظيمية للجين ألفا synuclein (الشكل 2) تمتد ما يقرب من 10 كيلو بايت، من المنبع NACP (غير مكون بيتا اميلويد الببتيد) ثنائي النوكليوتيد تكرار تسلسل ^1،2 خلال إنترون 2 ^3. نحن تشمل جزء من هذه المنطقة في لدينا بناء المراسل. وجدنا أن البلازميدات تحتوي على إنترون 2 الإجراءات الخاصة المطلوبة للنمو، كما هو مبين أدناه. البلازميدات luciferase المراسل، pGL4.10 وpGL4.75 (الشكل 3)، تتوفر تجاريا من PROMEGA ويمكن نشر باستخدام بروتوكولات البيولوجيا الجزيئية التقليدية.

1. تضخيم المكونات 2 من المروج ألفا synuclein في تقارير إتمام المشروعات منفصلة باستخدام وصفة في الجدول 1 والاشعال في الجدول 2.
2. VERIمنتجات السنة المالية PCR على agarose هلام ونظيفة باستخدام طقم تنقية Qiaquick PCR (في Qiagen)، يبلغ حجمه في 50 ميكرولتر من الشركة المصرية للاتصالات (تريس، EDTA). تخزين مزال 0.9 كيلو بايت شظية في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
3. هضم وحدة التخزين بالكامل من 3.4 كيلو بايت PCR جزء، فضلا عن 5 ميكروغرام من pGL4.10، مع SACI وXhoI. علاج ناقلات مع العجل الأمعاء الفوسفاتيز القلوية (روش) وهلام تنقية باستخدام عدة خيارات PureLink جل استخراج (إينفيتروجن).
4. Ligate جزء وناقلات باستخدام T4 يغاز الحمض النووي (نب). تنظيف تفاعل الانتهاء باستخدام عدة PureLink PCR مايكرو (إينفيتروجن)، يبلغ حجمه في 10 ميكرولتر TE العازلة.
5. تحويل 2 ميكرولتر من تنظيفها، رد فعل ربط في 20 ميكرولتر من الخلايا المختصة ElectroMAX Stbl4 (إينفيتروجن) وelectroporate وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. هزة في 30 درجة مئوية حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة. 2 نشر وحدات التخزين على لوحات LB تحتوي على 100 ملغ / مل الأمبيسلين واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
6. استخدام المسواك، حدد 4-6 مستعمرات صغيرة للتلقيح في 2 مل من السل (رائع مرق). تنمو هذه الثقافات miniprep في 30 ° C شاكر O / N.
7. تنقية DNA البلازميد من 1.5 مل من كل ثقافة miniprep استخدام عدة PureLink HiPure البلازميد Miniprep (إينفيتروجن).
8. هضم minipreps مع BamHI وelectrophorese على agarose هلام. استنساخ الصحيح ينبغي أن تنتج شظايا من 2.8 كيلو بايت و 4.9 كيلو بايت.
9. Restreak ثقافة miniprep المتبقية من استنساخ الصحيحة على LB (لوريا مرق) لوحة جديدة وتنمو عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
10. حدد مستعمرة صغيرة وتطعيم ثقافة كاتب السل 1.5 مل. يهز O / N عند 30 درجة مئوية. لا تدع الثقافة بداية تنمو إلى التشبع.
11. تمييع الثقافة بداية بأكمله إلى 150 مل من prewarmed السل ويهز عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، استخدم 1.5 مل من هذه الثقافة لminiprep إضافية والهضم للتأكد من أن استنساخ لم يتحور خلال replicati على.
12. تنقية DNA البلازميد من ثقافة المتبقية باستخدام عدة PureLink HiPure البلازميد Maxiprep (إينفيتروجن). العوائد المتوقعة من هذا البلازميد وسيطة هي 50-150 ميكروغرام لكل 150 مل من الثقافة.
13. ذوبان الجليد جزء 0.9 كيلوبايت المجمدة في الخطوة 1.2. كرر الخطوات 1،3-1،12 لاستنساخ جزء 0.9 كيلو بايت في البلازميد وسيطة، وهضم بدلا من ذلك مع KpnI وSACI. Ligate، تحويل، حدد، وتنمو لmaxipreps على النحو الوارد أعلاه. الهضم مع BamHI ينبغي أن تسفر شظايا من 5.8 كيلو بايت و 2.8 كيلو بايت. هذا هو البلازميد التي سيتم استخدامها للشاشة.

2. إعداد خلايا 293T، مراسل البلازميدات، ومكتبة الحمض النووي لفحص

هي المصنفة الخلايا 293T لأول مرة في لوحات 96 جيدا وtransfected في اليوم التالي. مخففة البلازميدات مراسل والسلطات الوطنية المعينة في لوحات 96 مكتبة جيدا. حصلنا على لوحات من الحمض النووي مكتبة ترنسفكأيشن الصف من كور الحمض النووي في مستشفى ماساتشوستس العام (الحصول = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). هذا البروتوكول transfects لوحة مكتبة واحدة في لوحات 2 متطابقة من الخلايا 293T (الشكل 1)، وينبغي بالتالي المصنف 2 لوحات خلايا لكل لوحة المكتبة ليتم عرضه.

ملاحظة: تنمو الخلايا في وسائل الإعلام دون الحمراء الفينول أو المضادات الحيوية، وهذه تتداخل مع المقايسات luciferase المراسل وزيادة سمية خلال ترنسفكأيشن، على التوالي.

1. لكل لوحة المكتبة ليتم عرضه، الخلايا resuspend 293T trypsinized إلى تركيز 1.5 × 10 ⁵ خلية / مل في DMEM تحتوي على 14٪ FBS. تصب في خزان معقم (Axygen).
2. وضع الخزان، 2 القاع واضحة، لوحات 96 جيدا (كورنينج)، وعلبة من نصائح مرشح الماصة (اجيلنت) على سطح الروبوت. الاستغناء 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من كل من لوحات، لكثافة 1.5 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر.
3. أجهزة الطرد المركزي لوحات الخلايا في 50 x ج لمدة 2 دقيقة، وذلك باستخدام سرعات منخفضة منحدر لضمان المساواةكثافة الخلية طوال كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO ₂ O / N.
4. تمييع اليراع وRenilla البلازميدات مراسل ل5 نانوغرام / ميكرولتر في وسائل الإعلام خالية من المصل. الجمع بين التخفيفات في نسبة 05:03 اليراع لRenilla البلازميد (من حيث الحجم) في أنبوب 15 مل المخروطية.
5. الماصة البلازميدات جنبا إلى جنب في كل بئر من لوحة 96 جيدا، والاستغناء 17 ميكرولتر لكل لوحة المكتبة، بالإضافة إلى 2-10 ميكرولتر الزائدة، في كل بئر.
6. الحصول ترنسفكأيشن الصف الحمض النووي لوحات المكتبة على النحو الوارد أعلاه وتضعف إلى 13.3 نانوغرام / ميكرولتر مع المياه خالية من الذيفان الداخلي. وينبغي أن يكون الحد الأدنى لحجم 28 ميكرولتر لكل بئر.

3. تنفيذ Transfections

في يوم 2 من الشاشة، و transfected البلازميدات مراسل والسلطات الوطنية المعينة مكتبة في الخلايا 293T.

1. لكل لوحة المكتبة، مزيج 107.5 ميكرولتر من RT Optifect (إينفيتروجن) مع 4.3 مل سائل الإعلام الحرة المصل (1:40 تمييع) في أنبوب البوليسترين. احتضان لمدة 5 دقائق على RT، ون تستغني 44 ميكرولتر (لكل لوحة المكتبة) في كل بئر من لوحة 96 جيدا، القاع V-البوليسترين (غرينر).
2. وضع لوحة من المخفف Optifect، البلازميدات مراسل (الخطوة 2.5)، السلطات الوطنية المعينة مكتبة (الخطوة 2.6)، وعلبة من نصائح الماصة على سطح الروبوت.
3. نضح 17 ميكرولتر من البلازميدات مراسل، 43 ميكرولتر من المخفف Optifect، و 26 ميكرولتر من الحمض النووي مكتبة، وإدراج فجوة الهواء 5 ميكرولتر بين كل الطموح. يجب أن يستنشق الحمض النووي مكتبة الماضي لمنع انتقال التلوث. الاستغناء محتويات نصائح في لوحة جديدة-V القاع البوليسترين، وخلط، والغطاء، ويترك جانبا لمدة 20 دقيقة للسماح للمجمعات الدهون / الحمض النووي لتشكيل. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، استبدال نصائح الماصة ولوحة المكتبة، وتكرار.
4. كشف وحة خليط Optifect / الحمض النووي ووضعه على سطح السفينة الروبوت مع 2 لوحات من الخلايا 293T. باستخدام مربع واحد من نصائح الماصة، نضح 80 ميكرولتر من Optifect: خليط الحمض النووي والاستغناء ببطء 40 ميكرولتر على كل لوحة من الخلايا. إذا العابرةfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع Optifect: لوحات الحمض النووي. تغطية الخلايا.
5. أجهزة الطرد المركزي لوحات الخلية في 1،200 x ج لمدة 30 دقيقة. تغطية والعودة إلى الحاضنة.
6. احتضان الخلايا لمدة 4-6 ساعة. خلال هذه الحضانة، وإعداد وسائل الإعلام الجديدة عن طريق خلط 12 مل DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين (CellGro) لكل لوحة مكتبة transfected. صب سائل الإعلام الجديدة في خزان العقيمة.
7. 2 وضع صناديق من نصائح الروبوت، لوحة واحدة من الخلايا، الخزان تحتوي على وسائل الإعلام الجديدة، وخزان النفايات على سطح السفينة الروبوت. نضح 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام من الخلايا والاستغناء في خزان النفايات تملأ جزئيا مع الايثانول 70٪. نصائح باستخدام الطازجة، نضح 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة والاستغناء ببطء على الخلايا. أكرر للجميع لوحات من الخلايا.
8. العودة إلى لوحات الحاضنة لمدة 48 ساعة.

4. تنفيذ ثنائي luciferase المراسل فحوصات

في يوم 4 من الشاشة، ويتم تنفيذ اليراع وRenilla المقايسات luciferase المراسل.

ملاحظة: الفحص المزدوج luciferase المراسل يتطلب إضافة متتابعة من 2 مخازن الفحص، 3X العازلة مقايسة اليراع و3X Renilla العازلة الفحص، كما هو موضح في الجدول رقم 3 لا تفرز اليراع وRenilla luciferases، وبالتالي يجب أن تكون هي lysed الخلايا قبل قياس luciferase النشاط. . يراعة العازلة مقايسة lyses الخلايا ويوفر الركيزة ليراعة luciferase؛ Renilla العازلة مقايسة يروي إشارة اليراع ويوفر الركيزة لluciferase المراسل Renilla.

1. لكل لوحة المكتبة، وإعداد 8 مل من العازلة 3X فحص يراعة من الحلول الأوراق المالية كما هو موضح في الجدول رقم 3، والاستغناء عن 82 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-V القاع جيدا.
2. لكل لوحة المكتبة، وأيضا إعداد 12 مل من العازلة 3X Renilla الفحص والاستغناء 122 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-V القاع جيدا. جانبا كل منيراعة وRenilla مخازن الفحص.
3. وضع مربع من نصائح الماصة، وخزان النفايات، و 2 لوحات من الخلايا (transfected من نفس لوحة المكتبة) على سطح الروبوت.
4. نضح 60 ميكرولتر من وسائل الإعلام من كل لوحة وتجاهل في خزان النفايات تملأ جزئيا مع الايثانول 70٪. بطانات وتوضع جانبا. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع مجموعات من لوحات.
5. 2 وضع صناديق من نصائح الماصة، لوحة من 3X العازلة مقايسة اليراع، ومجموعة من لوحات خلايا على سطح الروبوت.
6. نضح 40 ميكرولتر من العازلة 3X فحص اليراع وإضافته إلى لوحة الأولى من الخلايا، والخلط جيدا. التحول إلى نصائح الماصة جديدة، كرر لوحة الخلية الثانية. وضع الخلايا في RT لمدة 10 دقيقة لاستكمال تحلل. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، استبدال صناديق من النصائح وألواح الخلايا، وتكرار.
7. سجل التلألؤ من كل بئر من كل لوحة الخلية على luminometer، وتسجيل ل1 ثانية لكل بئر. العودة وحات للروبوتسطح السفينة.
8. 2 وضع صناديق من نصائح الماصة، لوحة من 3X Renilla العازلة الفحص، ومجموعة من لوحات خلايا على سطح الروبوت.
9. نضح 60 ميكرولتر من العازلة 3X Renilla الفحص، وإضافته إلى لوحة الأولى من الخلايا، والخلط جيدا. التبديل إلى مربع جديد من نصائح الماصة، كرر لوحة الخلية الثانية. إذا transfecting لوحات المكتبة متعددة، كرر لجميع مجموعات من لوحات الخلية.
10. سجل التألق من جميع لوحات على luminometer، وتسجيل كل بئر لمدة 1 ثانية على النحو الوارد أعلاه. تجاهل لوحات.

5. تحليل البيانات

1. حساب يراعة: نسبة Renilla التلألؤ ("F: نسبة R") لكل بئر بقسمة تهم إشارة يراعة من تهم إشارة Renilla.
2. حساب قيمة تحريض بقسمة F: نسبة R من كل بئر على المتوسط ​​F: نسبة R من لوحة، باستثناء أعلى وأدنى 25٪ من الآبار.
3. متوسط ​​القيم تحريض عبر مكرراتلوحة واحدة مكتبة transfected. تعتبر الجينات المحفزة أو قمع ألفا synuclein أكثر من ثلاثة أضعاف "يضرب" في هذه الشاشة وتخضع لمزيد من التحقق من صحة وشاشات الثانوي.

النتائج

القيم النموذجية luciferase المراسل، F: وتظهر نسب القيم والحث R لفترة واحدة نصف لوحة في الشكل (4) لاحظ جيدا في ضرب H2، وهو محفز 32 أضعاف. سوف الجينات المسببة للسمية المفرطة (على سبيل المثال، وأيضا E3)، أو الآبار التي و transfected سيئة، وإنتاج القيم المنخفضة لكلا اليراع وluciferas...

Discussion

وقد تورط ألفا synuclein في مرض باركنسون (PD) كمكون من الهيئات ليوي ^4، الادراج داخل الخلايا تعتبر اصم لهذا المرض. وربطت العديد من الدراسات رابطة الجينوم على نطاق تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد في ألفا synuclein مع خطر متزايد لالمتفرقة PD ^5،6،7. على الرغم من أن أقل شيوع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
			Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
Coenzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003