High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

Abstract

Vi presentiamo un protocollo di screening high-throughput rapido e poco costoso per identificare i regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina, un gene associato alla malattia di Parkinson. Cellule 293T sono transitoriamente trasfettate con plasmidi di una libreria di espressione ORF schierati, insieme con plasmidi reporter luciferasi, in un formato micropiastra un gene-per-bene. Attività di luciferasi di lucciola è analizzato dopo 48 ore per determinare gli effetti di ogni gene biblioteca upon alfasinucleina trascrizione, normalizzata a espressione da un costrutto di controllo interno (promotore hCMV dirigere Renilla luciferasi). Questo protocollo è facilitato da un robot banco racchiuso in un armadio biosicurezza, che esegue la movimentazione liquido asettico in formato a 96 pozzetti. Il nostro protocollo di trasfezione automatizzato è facilmente adattabile a high-throughput produzione biblioteca lentivirali o altri protocolli di screening funzionali che richiedono triple-transfezioni di un gran numero di plasmidi biblioteca unica nel coniugatonction con un insieme comune di plasmidi helper. Presentiamo anche un'alternativa economica e validato per disponibili in commercio, doppio reagenti luciferasi che impiega PTC124, EDTA, e pirofosfato di sopprimere l'attività luciferasi di lucciola prima della misura di Renilla luciferasi. L'utilizzo di questi metodi, abbiamo proiettato 7670 geni umani e identificato 68 regolatori di alfa-sinucleina. Questo protocollo è facilmente modificabile per indirizzare altri geni di interesse.

Introduzione

La capacità di identificare i principali elementi regolatori genetici ed i fattori che agiscono su di essi è fondamentale per l'esplorazione di numerosi processi biologici. Tuttavia, identificando i fattori che regolano l'espressione dei geni in tipi di cellule rare, come specifiche popolazioni di neuroni, può essere impegnativo. Qui vi presentiamo un protocollo per identificare nuovi regolatori trascrizionali di alfa-sinucleina (SNCA), un gene associato con la malattia di Parkinson ed espresso nei neuroni dopaminergici nella substantianigra pars compacta regione del mesencefalo. Compiamo questo utilizzando uno schermo giornalista high-throughput, dual-luciferasi, in vitro decostruire l'espressione di alfa-sinucleina in cellule 293T. Il promotore alfasinucleina viene clonato in un plasmide contenente il gene reporter di luciferasi di lucciola. Un plasmide disponibile in commercio, contenente la luciferasi Renilla sotto il controllo di un promotore costitutivamente attivo serve come controllo interno. Thescostrutti e giornalista sono co-trasfettati in cellule 293T in micropiastre con plasmidi da una libreria di espressione del DNA, in modo che ogni bene è trasfettate con una singola libreria plasmide. Dopo 48 ore, l'attività della luciferasi per ogni giornalista è misurata in sequenza usando un test a doppio bagliore. L'espressione relativa di alfa-sinucleina in risposta a ciascun gene libreria viene dedotto dal rapporto di lucciola: attività di luciferasi Renilla in ciascun pozzetto (F: rapporto R) dopo normalizzazione basato piastra.

Questo protocollo consente di schermare un gran numero di geni (~ 2,500 a settimana) per la loro capacità di transattivare un gene reporter utilizzando manodopera minima (1-2 persone) e un costo minimo (circa $ 3 costo reagente per test micropiastra). Regolatori trascrizionali di geni neuronali (ad esempio, alfa-sinucleina), che sono difficili da studiare in neuroni in coltura refrattari alla manipolazione genetica, possono essere confrontati side-by-side in questo saggio funzionale diretta. Noi includiamo nel nostroprotocollo un metodo dettagliato per la clonazione e la crescita dei plasmidi contenenti il ​​promotore alfa-sinucleina, poiché abbiamo scoperto che i plasmidi contenenti questa regione sono instabile quando cresciuta con procedure convenzionali (vedi Discussione). Abbiamo anche un'alternativa economica per i reagenti disponibili in commercio dual-luciferasi per saggi high-throughput. Questo protocollo può essere facilmente adattato per indirizzare altri elementi regolatori di interesse, o su qualsiasi processo che richiede alto throughput trasfezioni transitorie.

Protocollo

Per una panoramica sperimentale, vedi Figura 1.

1. Preparare plasmidi reporter contenente la alfa-sinucleina Promoter

Elementi regolatori del gene alfa-sinucleina (Figura 2) si estendono circa 10 kb, da monte NACP (non Un componente di beta amiloide) sequenza dinucleotide repeat ^1,2 attraverso introne 2 ^3. Includiamo una porzione di questa regione in il nostro costrutto giornalista. Abbiamo trovato che i plasmidi contenenti introni 2 richieste procedure speciali per la crescita, come indicato di seguito. I plasmidi di luciferasi, pGL4.10 e pGL4.75 (Figura 3), sono disponibili in commercio da Promega e possono essere propagate utilizzando protocolli di biologia molecolare convenzionali.

1. Amplificare i 2 componenti del promotore alfasinucleina in PCR separati utilizzando la ricetta nella Tabella 1 e primer in Tabella 2.
2. Verify prodotti di PCR su un gel di agarosio e pulite utilizzando il kit di purificazione PCR Qiaquick (Qiagen), eluendo in 50 ml di TE (Tris-EDTA). Conservare il eluito 0,9 kb frammento a -20 ° C per un uso futuro.
3. Digerire l'intero volume del 3,4 kb frammento di PCR, e 5 ug di pGL4.10, con SacI e XhoI. Trattare il vettore con il vitello Intestino fosfatasi alcalina (Roche) e gel purificare utilizzando il kit PureLink rapida Gel Extraction (Invitrogen).
4. Legare il frammento e il vettore utilizzando T4 DNA ligasi (NEB). Pulire la reazione compilato utilizzando il kit PureLink PCR Micro (Invitrogen), eluizione in 10 microlitri di buffer TE.
5. Trasforma 2 ml di pulito, reazione di ligazione in 20 microlitri di cellule competenti ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) e l'elettroporazione secondo le istruzioni del produttore. Agitare in un incubatore a 30 ° C a 225 rpm per 90 min. Distribuire 2 volumi su piastre LB contenenti 100 mg / ml ampicillina e incubare a 30 ° C per 2 giorni.
6. Usando uno stuzzicadenti, selezionare 4-6 piccole colonie per inoculo in 2 ml di TB (Terrific Broth). Coltivare queste culture Miniprep in 30 ° C shaker O / N.
7. Purificare il DNA plasmidico da 1,5 ml di ciascuna coltura miniprep utilizzando il kit PureLink HiPure Plasmid Miniprep (Invitrogen).
8. Digerire le minipreps con BamHI e elettroforesi su gel di agarosio. Il clone corretto dovrebbe produrre frammenti di 2.8 kb e 4.9 kb.
9. Restreak il restante cultura miniprep dalla corretta clone su un LB (Luria Broth) piastra fresca e crescere a 30 ° C per 2 giorni.
10. Selezionare una piccola colonia e inoculare una coltura starter da 1,5 ml TB. Agitare O / N a 30 ° C. Non lasciate che la coltura starter crescere fino a saturazione.
11. Diluire l'intera cultura di avviamento in 150 ml di TB preriscaldata e agitare a 30 ° C per 2 giorni. Prima di procedere alla fase successiva, con 1,5 ml di questa coltura per un miniprep e digestione supplementare per confermare che il clone non mutano durante replicati on.
12. Purificare il DNA plasmidico dal restante coltura utilizzando il kit PureLink HiPure Plasmid Maxiprep (Invitrogen). Rendimenti attesi di questo plasmide intermedio sono 50-150 g per 150 ml di cultura.
13. Scongelare il frammento di 0,9 kb congelati nel passaggio 1.2. Ripetere i passaggi 1,3-1,12 per clonare il frammento di 0,9 kb nel plasmide intermedio, digerire invece con KpnI e SacI. Legare, trasformare, selezionare e crescere per maxipreps come sopra. Digestione con BamHI dovrebbe produrre frammenti di 5.8 kb e 2,8 kb. Questo è il plasmide che verrà utilizzato per lo schermo.

2. Preparare Cellule 293T, Reporter, plasmidi e DNA Library for Screening

Cellule 293T vengono prima seminate in piastre da 96 pozzetti e trasfettate il giorno seguente. Plasmidi reporter e DNA biblioteca sono diluiti in piastre da 96 pozzetti. Abbiamo ottenuto lastre di trasfezione-grade libreria di DNA dal Nucleo DNA presso il Massachusetts General Hospital (ottenere = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Questo protocollo transfects una singola piastra di libreria in 2 piastre identiche di cellule 293T (Figura 1), quindi 2 piastre di celle deve essere seminate per ciascuna piastra biblioteca da schermare.

Nota: Coltivare cellule in media senza rosso fenolo o antibiotici, in quanto questi interferiscono con i saggi di luciferasi e aumentano la tossicità durante la transfezione, rispettivamente.

1. Per ciascuna piastra libreria da proiettato, risospendere le cellule 293T trypsinized ad una concentrazione di 1,5 x 10 ⁵ cellule / ml in DMEM contenente 14% FBS. Versare in un serbatoio sterile (Axygen).
2. Posizionare il serbatoio, 2 chiare a fondo, piastre da 96 pozzetti (Corning), e una scatola di suggerimenti filtro pipetta (Agilent) sul ponte robot. Pipettare 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di entrambe le piastre, per una densità di 1,5 x 10 ⁴ cellule per pozzetto.
3. Centrifugare le piastre cellulari a 50 xg per 2 minuti, utilizzando una velocità di rampa basse per garantire la paritàdensità delle cellule durante ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C e 10% di CO ₂ O / N.
4. Diluire la lucciola e Renilla plasmidi reporter a 5 ng / ml in mezzi privi di siero. Combinare le diluizioni in un rapporto di 05:03 lucciola di Renilla plasmide (in volume) in un tubo da 15 ml.
5. Preparare la plasmidi combinati in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, dosaggio 17 ml per piastra biblioteca, oltre a 2-10 ml in eccesso, in ogni pozzetto.
6. Ottenere trasfezione-grade lastre biblioteca DNA come sopra e diluire a 13,3 ng / ml con acqua priva di endotossine. Il volume minimo per bene dovrebbe essere di 28 ml.

3. Eseguire trasfezioni

Il giorno 2 dello schermo, plasmidi reporter e DNA libreria sono trasfettati in cellule 293T.

1. Per ogni piatto biblioteca, mescolare 107,5 ml di RT Optifect (Invitrogen) con 4,3 ml di mezzi privi di siero (1:40 diluizione) in una provetta di polistirene. Incubare per 5 min a temperatura ambiente, e lan dispensare 44 microlitri (per piastra biblioteca) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, polistirolo V-fondo (Greiner).
2. Posizionare la piastra di Optifect diluito, plasmidi reporter (Passo 2.5), DNA biblioteca (Punto 2.6), e una scatola di puntali sul ponte robot.
3. Aspirare 17 ml di plasmidi reporter, 43 ml di Optifect diluita, e 26 ml di DNA biblioteca, inserendo una intercapedine d'aria 5 microlitri tra ogni aspirazione. Il DNA biblioteca dovrebbe essere aspirato ultimo per evitare la contaminazione incrociata. Versare il contenuto delle punte in una nuova lastra di polistirene V-fondo, mescolare, coprire e mettere da parte per 20 minuti per consentire complessi lipide / DNA per formare. Se trasfettando piatti biblioteca multipli, sostituire i puntali e la piastra biblioteca, e ripetere.
4. Scoprire la piastra miscela di Optifect / DNA e posizionarlo sul ponte robot con 2 piastre di cellule 293T. Utilizzando un unico box di puntali, aspirare 80 ml di Optifect: miscela di DNA e lentamente dispensare 40 microlitri su ogni piatto di cellule. Se transfezione piatti biblioteca multiple, ripetere per tutti Optifect: lastre DNA. Coprire le cellule.
5. Centrifugare piastre delle celle a 1.200 xg per 30 min. Coprire e tornare alla incubatrice.
6. Incubare le cellule per 4-6 ore. Durante questa incubazione, preparare supporti fresco miscelando 12 ml di DMEM contenente 10% FBS e 10 pg / ml ciprofloxacina (Cellgro) per ciascuna piastra biblioteca transfettate. Versare mezzi freschi in un serbatoio sterile.
7. Posizionare 2 scatole di punte robot, una singola piastra di cellule, il serbatoio contenente terreno fresco, e un serbatoio di rifiuti sul ponte robot. Aspirare 100 microlitri di media dalle cellule e dispensare nel serbatoio rifiuti parzialmente riempito con etanolo al 70%. Usando le punte fresche, aspirare 100 ml di mezzi freschi e lentamente dispensare sulle celle. Ripetere l'operazione per tutte le piastre di cellule.
8. Piastre Ritorno al incubatore per 48 ore.

4. Eseguire Dual-luciferasi saggi

Il giorno 4 dello schermo, lalucciola e Renilla saggi di luciferasi vengono eseguiti.

Nota: Il dosaggio dual-luciferasi richiede l'aggiunta sequenziale di 2 buffer di saggio, 3X tampone lucciola saggio e tampone di saggio 3X Renilla, come descritto nella Tabella 3 di lucciola e Renilla luciferasi non sono secreti, così le cellule devono essere lisate prima di misurare l'attività di luciferasi. . Tampone di saggio lucciola lisa le cellule e fornisce substrato per la luciferasi di lucciola; tampone Renilla estingue il segnale lucciola e fornisce substrato per la luciferasi Renilla.

1. Per ciascuna piastra biblioteca, preparare 8 ml di tampone 3X lucciola saggio da soluzioni madre come descritto nella Tabella 3, e dispensare 82 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V.
2. Per ciascuna piastra biblioteca, inoltre preparare 12 ml di tampone 3X Renilla e dispensare 122 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Mettere da parte sia l'lucciola e Renilla buffer di analisi.
3. Posizionare una casella di puntali, un serbatoio di rifiuti, e 2 piatti di cellule (trasfettate dallo stesso piatto biblioteca) sul ponte robot.
4. Aspirare 60 ml di mezzi di comunicazione di ogni piatto e gettare nel serbatoio rifiuti parzialmente riempito con il 70% di etanolo. Piastre di copertura e mettere da parte. Se trasfettando piatti biblioteca multipli, ripetere per tutti i set di piatti.
5. Mettere 2 scatole di puntali, il piatto di 3X tampone di lucciola saggio, e una serie di piatti cellulari sul ponte robot.
6. Aspirare 40 ml di 3X tampone di lucciola saggio e aggiungere al primo piatto di cellule, mescolando bene. Il passaggio a nuovi puntali, ripetere per la seconda piastra di cella. Posizionare cellule a temperatura ambiente per 10 minuti per completare la lisi. Se trasfettando piatti biblioteca più, sostituire le scatole di punte e piastre cellulari, e ripetere.
7. Record luminescenza da ciascun pozzetto di ciascuna piastra di cella su un luminometro, registrando per 1 sec per pozzetto. Piastre Ritorno al robotdeck.
8. Mettere 2 scatole di puntali, il piatto di tampone 3X Renilla, e una serie di piatti cellulari sul ponte robot.
9. Aspirare 60 ml di tampone 3X Renilla, e aggiungerlo al primo piatto di cellule, mescolando bene. Il passaggio a una nuova scatola di puntali, ripetere per la seconda piastra di cella. Se trasfettando piatti biblioteca multipli, ripetere per tutti i set di piatti cellulari.
10. Record luminescenza da tutte le piastre su un luminometro, registrando ogni pozzetto per 1 sec come sopra. Eliminare le piastre.

5. Analisi dei dati

1. Calcolare la lucciola: rapporto Renilla luminescenza ("F: rapporto R") per ogni pozzetto dividendo conti di segnale lucciola dai conti di segnale Renilla.
2. Calcolare il valore di induzione dividendo il F: rapporto R di ciascun pozzetto dalla F media: rapporto R della piastra, escludendo il più alto e più basso del 25% dei pozzi.
3. La media dei valori di induzione di tutti replicatiper una piastra biblioteca transfettate. I geni che inducono o reprimendo l'alfa-sinucleina più di tre pieghe sono considerati "hits" in questa schermata e sono soggetti a ulteriore convalida e schermi secondari.

Risultati

Valori tipici luciferasi, F: tassi di R e valori di induzione per un singolo semipiastra sono mostrati in Figura 4 Nota il colpo in ben H2, un induttore 32 volte.. Geni che causano eccessiva tossicità (per esempio, ben E3), o pozzi che erano scarsamente transfettate, produrranno valori bassi per entrambi lucciola e Renilla luciferasi, ma un valore medio di induzione. Geni che causano induzione non specifico di attività di luciferasi, forse attraverso l'interazione con la spina do...

Discussione

Alfasinucleina è stato implicato nel morbo di Parkinson (PD) come componente di corpi di Lewy ^4, inclusioni intracellulari considerati patognomonici per la malattia. Numerosi studi di associazione genome-wide hanno collegato polimorfismi a singolo nucleotide in alfa-sinucleina con aumentato rischio di sporadici PD ^5,6,7. Sebbene meno comune rispetto sporadici PD, PD familiare può essere causato anche da mutazioni nel alfa-sinucleina ^8, così come la duplicazione e triplicazione della a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
			Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
Coenzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003