АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем быстрый и недорогой метод скрининга для выявления транскрипционных регуляторов с использованием высокой пропускной роботов трансфекций и самодельный двойного свечения люциферазы. Этот протокол быстро генерирует прямые бок о бок функциональные данные для тысяч генов и легко изменяемый целевой любой интерес ген.

Аннотация

Мы представляем быстрый и недорогой протокол высокопроизводительного скрининга для выявления транскрипционные регуляторы альфа-синуклеина, гена, связанного с болезнью Паркинсона. Клетки 293Т временно трансфицировали плазмидами, из упорядоченной библиотекой экспрессии ORF, вместе с репортера люциферазы плазмиды, в формате один ген-на-луночный микропланшет. Активность люциферазы Firefly анализируют после 48 часов, чтобы определить влияние каждого гена библиотеки на альфа-синуклеина транскрипции, нормированной к выражению из конструкции внутреннего контроля (промоутер ЦМВ направляя Renilla люциферазу). Этот протокол облегчается помощью настольного робота, заключенный в шкафу биобезопасности, который выполняет асептической обработки жидкого в формате 96-а. Наш автоматизированный протокол трансфекции легко адаптируется к высокой пропускной производства библиотеки лентивирусный или других функциональных протоколов скрининга, требующих тройных трансфекций большого числа уникальных библиотечных плазмид в сопряnction с общим набором вспомогательных плазмид. Мы также представляем недорогой и проверенную альтернативу коммерчески доступные, двойные люциферазы реагентов в которой работает PTC124, ЭДТА, и пирофосфат для подавления светлячка активность люциферазы перед измерением Renilla люциферазы. Используя эти методы, мы провели скрининг 7670 генов человека и определили 68 регуляторов альфа-синуклеина. Этот протокол можно легко модифицировать в отношении других представляющих интерес генов.

Введение

Способность идентифицировать ключевые генетические регуляторные элементы и факторы, которые действуют на них имеет основополагающее значение для изучения многочисленных биологических процессов. Тем не менее, выявление факторов, которые регулируют экспрессию генов в редких типов клеток, таких как конкретных нейронных популяций, может оказаться непростой задачей. Здесь мы приводим протокол для выявления новых регуляторов транскрипции альфа-синуклеина (SNCA), ген, связанный с болезнью Паркинсона и выражается в дофаминергических нейронов в substantianigra Парс компакты область среднего мозга. Мы добиваемся этого с помощью высокой пропускной двойного люциферазы, в пробирке репортер экран деконструировать выражение альфа-синуклеина в клетках 293Т. Альфа-синуклеина промотор сначала клонировали в репортерной плазмидой, содержащей ген люциферазы светлячка. Коммерчески доступный плазмиду, содержащую люциферазы Renilla под контролем постоянно активной промотора служит в качестве внутреннего контроля. Фесе репортер конструкции котрансфицируют в клетках 293Т в микропланшетах с плазмидами с библиотекой экспрессии ДНК, так, что каждый хорошо трансфицируют с одной плазмидной библиотеки. Через 48 ч активность люциферазы для каждого репортера измеряется последовательно с использованием двойного свечения анализа. Относительную экспрессию альфа-синуклеина в ответ на каждый библиотеки генов выводится на отношение светлячка: активности люциферазы Renilla в каждой лунке (F: отношение R) после пластины на основе нормализации.

Этот протокол обеспечивает возможность экранировать большое количество генов (~ 2500 в неделю) за их способность трансактивировать ген-репортер с использованием минимального рабочей силы (на 1-2 человек) и минимальную стоимость (около $ 3 Стоимость реагента на микропланшет анализа). Транскрипционных регуляторов из нейрональных генов (например, альфа-синуклеина), которые трудно изучать в культуре нейронов огнеупорных в генетических манипуляций, можно сравнить бок о бок в этой прямой функциональном анализе. Мы включаем в нашПротокол подробный способ для клонирования и роста плазмид, содержащих альфа-синуклеина промотор, так как мы обнаружили, что плазмиды, содержащие эту область нестабильны при выращивании с обычными способами (см. обсуждение). Мы также включать недорогую альтернативу коммерчески доступные двойного люциферазы реагенты для высокой пропускной анализов. Этот протокол может быть легко адаптирована в отношении других регуляторных элементов, представляющих интерес, или к любому процессу, требующих высокой пропускной способности временной трансфекции.

протокол

Для экспериментального обзора, см. рисунок 1.

1. Подготовьте Reporter плазмиды, содержащие альфа-синуклеина Промоутер

Регуляторные элементы гена альфа-синуклеина (рис. 2) охватывают около 10 Кб, от вышестоящего NACP (не бета компонентом амилоидного пептида) динуклеотид повторного последовательности 1,2 через интрона 2 3. Мы включать в себя часть этого региона в наш корреспондент конструкция. Мы обнаружили, что плазмиды, содержащие интрон 2 необходимых специальных процедур для роста, как описано ниже. Люциферазы плазмиды, pGL4.10 и pGL4.75 (рис. 3), являются коммерчески доступными от Promega и можно размножать, используя обычные протоколы молекулярной биологии.

  1. Усиливать 2 компоненты альфа-синуклеина промотора в отдельных ПЦР с использованием рецепт в таблице 1 и праймеров в таблице 2.
  2. ВериFY продукты ПЦР в агарозном геле и чистым с использованием набора для очистки Qiaquick ПЦР (Qiagen), элюируя в 50 мкл ТЕ (Трис-ЭДТА). Хранить элюированной 0,9 т.п.н. фрагмент при -20 ° С для последующего использования.
  3. Дайджест весь объем 3,4 кб ПЦР фрагмента, а также 5 мкг pGL4.10, с SacI и XhoI. Treat вектор с щелочной фосфатазой кишечника теленка (Roche) и гель очищают с использованием набора Quick PureLink Gel Extraction (Invitrogen).
  4. Лигируют фрагмент и вектор использованием Т4 ДНК-лигазы (НЭБ). Очистите заполненную реакции с использованием набора PureLink ПЦР Micro (Invitrogen), элюируя в 10 мкл ТЕ-буфера.
  5. Transform 2 мкл очищенной, реакции связывания в 20 мкл Electromax Stbl4 компетентных клеток (Invitrogen) и электропорации в соответствии с инструкциями изготовителя. Взболтать в 30 ° C инкубаторе при 225 оборотах в минуту в течение 90 мин. Распространение 2 тома на LB-планшеты, содержащие 100 мг / мл ампициллина и инкубировали при 30 ° С в течение 2 дней.
  6. Используя зубочистку, выберите 4-6 небольшие колонии для прививки в 2 мл ТБ (Потрясающе Бульон). Вырастить эти Miniprep культур в 30 ° C шейкер O / N.
  7. Очищают плазмидной ДНК из 1,5 мл каждой культуры Miniprep с использованием набора PureLink HiPure Плазмиду Miniprep (Invitrogen).
  8. Дайджест минипрепараты с BamHI и électrophorèse на агарозном геле. Правильный клон должен производить фрагменты 2,8 кб и 4,9 кб.
  9. Restreak оставшееся минипрепаративную культуру от правильного клона на свежей LB (Luria Broth) пластины и расти при 30 ° С в течение 2 дней.
  10. Выберите небольшую колонию и инокуляции 1,5 мл ТБ закваски. Встряхнуть O / N при 30 ° С Не позволяйте закваска вырасти до насыщения.
  11. Развести всю культуру стартера в 150 мл нагретого ТБ и встряхните при 30 ° С в течение 2 дней. Прежде чем перейти к следующему шагу, используйте 1,5 мл этой культуры за дополнительную Miniprep и пищеварения, чтобы подтвердить, что клон не мутировал во replicati на.
  12. Очищают плазмидной ДНК от остальной культуры с использованием набора PureLink HiPure Плазмиду максипреп (Invitrogen). Ожидаемые выходы этой промежуточной плазмиды являются 50-150 мкг на 150 мл культуры.
  13. Оттепель 0,9 кб фрагмент заморожены в шаге 1.2. Повторите шаги 1,3 до 1,12 клонировать 0,9 кб фрагмент в промежуточный плазмиды, переваривая вместо с KpnI и SacI. Перевязывать, преобразования, выберите, и расти в течение maxipreps, как указано выше. Пищеварение с BamHI должно дать фрагменты 5,8 кб и 2,8 кб. Это плазмида, которая будет использоваться для экрана.

2. Подготовьте 293Т, корреспондент плазмиды и ДНК-библиотеки для скрининга

293T-клетки сначала высевали в 96-луночные планшеты и трансфицировали на следующий день. Reporter плазмиды и библиотеки ДНК разбавляют в 96-луночных планшетах. Мы получили тарелки трансфекции класса библиотеки ДНК из ДНК Ядра Массачусетского общего госпиталя (получить = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Этот протокол transfects единую библиотеку пластину на 2 одинаковых пластин 293Т (рис. 1), при этом 2 пластины клеток должны быть посеяны для каждой библиотеки пластины для экранированного.

Примечание: Рост клеток в средствах массовой информации без фенола красного или антибиотиков, так как они мешают люциферазы анализов и увеличить токсичность при трансфекции соответственно.

  1. Для каждой библиотеки пластина будет показан, ресуспендируют трипсином клетки 293Т до концентрации 1,5 × 10 5 клеток / мл в DMEM, содержащей 14% FBS. Налейте в стерильный резервуар (Axygen).
  2. Поместите резервуар, 2 ясно дном, 96-луночные планшеты (Corning), и коробку советы фильтр пипетки (Agilent) на робота палубе. Внесите 100 мкл клеток в каждую лунку обеих пластин, для плотности 1,5 х 10 4 клеток на лунку.
  3. Центрифуга клеток пластин при 50 мкг в течение 2 мин, используя низкую скорость рампы для обеспечения равныхплотность клеток на протяжении каждую лунку. Инкубируют при 37 ° С и 10% CO 2 O / N.
  4. Развести светлячка и Renilla репортер плазмиды до 5 нг / мкл в сыворотки среде. Смешайте разведений в соотношении 5:03 до светлячка Renilla плазмиды (по объему) в 15 мл коническую пробирку.
  5. Пипетка объединенные плазмид в каждую лунку 96-луночного планшета, дозирования 17 мкл на библиотеки пластины, плюс 2-10 мкл избыток, в каждую лунку.
  6. Получить трансфекции-класса библиотеки ДНК пластины, как указано выше и разбавить до 13,3 нг / мкл с эндотоксинов воде. Минимальный объем на лунку должно быть 28 мкл.

3. Выполните трансфекций

В день 2 части экрана, репортер плазмиды и библиотеки ДНК трансфицировали в клетки 293Т.

  1. Для каждой библиотеки планшета смешайте 107,5 мкл RT Optifect (Invitrogen) с 4,3 мл сыворотки среде (разведение 1:40) в полистирольной трубки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре ин обойтись 44 мкл (на библиотеки пластины) в каждую лунку 96-а, полистирол V-дном пластины (Greiner).
  2. Место пластины разбавленного Optifect, корреспондент плазмиды (шаг 2.5), Библиотека ДНК (шаг 2.6), и коробку пипетки советы по робота палубе.
  3. Аспирируйте 17 мкл репортер плазмид, 43 мкл разбавленного Optifect и 26 мкл библиотеки ДНК, вставляя воздушный зазор 5 мкл между каждой аспирации. Библиотека ДНК должны быть атмосферный прошлом, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Внесите содержимое советы в новый полистирола V дном тарелку, перемешать, крышку, и отложите в сторону в течение 20 мин, чтобы позволить комплексы липидов / ДНК с образованием. Если трансфекции нескольких библиотек пластины, заменить советы пипетки и библиотеки пластину, и повторите.
  4. Раскройте Optifect / ДНК смеси тарелку и положите его на робота палубе с 2 пластинами 293Т. Использование одного коробку советы пипетки, аспирируйте 80 мкл Optifect: смесь ДНК и медленно обойтись 40 мкл на каждой пластине клеток. Если трансfecting несколько библиотек тарелки, повторите для всех Optifect: тарелки ДНК. Обложка клетки.
  5. Центрифуга клеток пластин при 1200 мкг в течение 30 мин. Накройте и возвращают в инкубатор.
  6. Инкубируйте клетки в течение 4-6 часов. Во время этой инкубации подготовить свежей средой путем смешивания 12 мл DMEM, содержащей 10% FBS и 10 мкг / мл ципрофлоксацин (Cellgro) для каждого библиотечного трансфицированных пластины. Налейте свежей средой в стерильный резервуар.
  7. Поместите 2 коробки советы робот, одной пластины из клеток, резервуар, содержащий свежую среду, и резервуар с отходами на робота палубе. Аспирируйте 100 мкл СМИ из клеток и обойтись в резервуар отходов, частично заполненной 70% этанола. Использование свежих советы, аспирации 100 мкл свежей среды и медленно обойтись на клетки. Повторите эти действия для всех пластин клеток.
  8. Возврат пластины в инкубатор на 48 часа.

4. Выполните Dual-люциферазы Анализы

На 4 день экрана,светлячка и Renilla люциферазы анализы выполняются.

Примечание: двойной люциферазы Анализ требует последовательное добавление 2 анализа буферов, 3x светлячка буфере для анализа и 3X Renilla буфере для анализа, как описано в таблице 3 Firefly и Renilla люциферазы не секретируется, таким образом клетки лизируют необходимо перед измерением активности люциферазы. . Firefly аналитического буфера лизирует клетки и обеспечивает субстрат для люциферазы светляков; Renilla аналитического буфера утоляет светлячка сигнал и обеспечивает субстрат для люциферазы Renilla.

  1. Для каждой библиотеки пластины, готовить 8 мл 3X ​​светлячка буфере для анализа из маточных растворов, как описано в таблице 3, и распределить 82 мкл в каждую лунку V дном 96-луночного планшета.
  2. Для каждой библиотеки пластины, также готовить 12 мл 3X ​​Renilla буфере для анализа и обойтись 122 мкл в каждую лунку V дном 96-луночного планшета. Отложите каксветлячка и Renilla анализов буферы.
  3. Поместите коробку советы пипетки, резервуар с отходами и 2 тарелки клеток (трансфицированную из того же библиотеки пластины) на робота палубе.
  4. Аспирируйте 60 мкл СМИ из каждой чашки и отбросить в резервуаре отходов, частично заполненной 70% этанола. Накладки и отложите в сторону. Если трансфекции нескольких библиотек тарелки, повторите для всех наборов пластин.
  5. Поместите 2 коробки советы пипетки, тарелку с 3-кратным светлячка буфере для анализа, и набор клеток пластин на робота палубе.
  6. Аспирируйте 40 мкл 3Х светлячка буфере для анализа и добавить его к первой пластине клеток, тщательно перемешивая. Переход на новые подсказки пипетки, повторите для второго сотового пластины. Поместите клетки при комнатной температуре в течение 10 мин для завершения лизиса. Если трансфекции нескольких библиотек тарелки, замените коробки советы и клеточных пластин, и повторите.
  7. Запись люминесценции из каждой лунки каждой клеточной пластинки на люминометре, запись в течение 1 секунды на лунку. Возврат пластины к роботупалубе.
  8. Поместите 2 коробки советы пипетки, тарелку с 3X Renilla буфере для анализа, и набор клеток пластин на робота палубе.
  9. Аспирируйте 60 мкл 3X Renilla буфере для анализа, и добавить его в первой пластинки клеток, тщательно перемешивая. Переход на новую коробку советы пипетки, повторите для второго сотового пластины. Если трансфекции нескольких библиотек тарелки, повторите для всех наборов клеток пластин.
  10. Запись люминесценции от всех пластин на люминометре, записи в каждую лунку за 1 сек, что и выше. Откажитесь пластины.

5. Анализ данных

  1. Рассчитать светлячок: соотношение Renilla люминесценции ("F: R отношение") для каждой скважины путем деления графов светлячка сигнала по пунктам сигнала Renilla.
  2. Рассчитать значение индукции путем деления F: R отношение каждую лунку по средней F: R отношение пластины, за исключением самой высокой и самой низкой 25% скважин.
  3. Среднее значение на основании значения индукции через повторахдля одного трансфицированных библиотеки пластины. Гены, вызывающие или подавляя альфа-синуклеина более трех складок считаются "хиты" на этом экране и подлежат дальнейшему проверки и средних экранов.

Результаты

Типичные значения люциферазы, F: отношения R и индукционные значения для одной половины пластины показано на рисунке 4 Обратите внимание на удар в а Н2, 32-кратным индуктора.. Гены, вызывающие чрезмерное токсичности (например, хорошо E3), или скважины, которые были плохо трансфициро...

Обсуждение

Альфа-синуклеина был вовлечен в болезни Паркинсона (БП) в качестве компонента тельцами Леви, 4 внутриклеточных включений, рассмотренных патогномоничными для заболевания. Многочисленные генома исследования ассоциации связывают одиночных нуклеотидных полиморфизмов в альфа-сину...

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана роялти, полученных лицензионных BacMamreagents (патент США 5731182).

Благодарности

Мы благодарим Джона Darga в MGH ДНК сердечниками для подготовки скрининга ДНК библиотеки. Кристофер Chigas Перкин Элмер оказали неоценимую поддержку нашей Wallac 1420 люминометра. Стивен Ciacco и Мартин Thomae из Agilent оказала поддержку робота Браво. Мы благодарим Рон Джонсон и Стив Тита на NIH для щедро обеспечивая их протокол анализа люциферазы двойного свечения.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
QIAQuick PCR Purification KitQiagen28106
PureLink Quick Gel Extraction KitInvitrogenK2100-12
PureLink PCR Micro KitInvitrogenK310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep KitInvitrogenK2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep KitInvitrogenK2100-07
Bravo RobotAgilent-
Robot Pipet Tips with FilterAgilent19477-022
Robot Pipet Tips without FilterAgilent19477-002
Clear-bottomed 96-well PlatesCorning3610
ReservoirsAxygenRES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well PlateGreiner651101
Polypropylene V-bottomed 96-well PlateGreiner651201
Adhesive Plate CoversCryoStuff#FS100
Reagent
Phusion DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530L
BAC 2002-D6Invitrogen2002-D6
Calf Intestine Alkaline PhosphataseRoche10713023001
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202L
pGL4.10PromegaE6651
pGL4.74PromegaE6931
ElectroMAX Stbl4 Competent CellsInvitrogen11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent CellsInvitrogen18265-017
DMEM without Phenol RedInvitrogen31053-028
OptifectInvitrogen12579017
CiprofloxacinCellGro61-277-RF
Tris-Hydrochloride PowderSigma93287
Tris-Base Powder Sigma93286
Triton X-100 Pure LiquidFisherBP151-100
DTTInvitrogen15508-013
Coenzyme ANanolight309
ATPSigmaA6419
LuciferinInvitrogenL2912
h-CTZNanolight301
PTC124SelleckBiochemicalsS6003

Ссылки

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

88

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены