Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Özet

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Özet

Bu alfa-sinüklein, Parkinson hastalığı ile ilişkili bir genin transkripsiyonel düzenleyici belirlemek için hızlı ve ucuz bir yüksek verimli tarama protokol mevcut. 293T hücreleri, bir tek gen başına oyuk mikro biçimde, bir arada lusiferaz haberci plazmidleriyle, bir dizilmiş ORF sentezleme kütüphanesinden plazmid ile transfekte edilir. Ateşböceği lusiferaz aktivitesi, bir iç kontrol yapısı (Renilla lusiferazı yönlendiren bir hCMV promotörü) ekspresyon normalize alfa-sinüklein transkripsiyon, üzerine her bir kütüphane genin etkilerini belirlemek için 48 saat sonra test edilir. Bu protokol, 96 kuyulu formatta aseptik sıvı taşıma yapan bir biyo-güvenlik kabini içinde bulunan bir tezgah üstü robot tarafından kolaylaştırılır. Bizim otomatik transfeksiyon protokol yüksek verimli bir kitaplık üretimi veya lentiviral konjugat olarak eşsiz bir kütüphane plazmidlerin çok sayıda üç transfections gerektiren diğer fonksiyonel eleme protokollere kolayca uyarlanabiliryardımcı plazmidin ortak bir set ile nction. Ayrıca, ucuz ve geçerli bir alternatif sunmak PTC124'ün, EDTA, ve önceki Renilla lusiferaz ölçümü ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için pirofosfat kullanan ticari olarak temin edilebilen, çift lusiferaz reaktifler için. Bu yöntemler kullanılarak, 7670 insan genleri elenir ve alfa-sinüklein 68 regülatörleri belirlenmiştir. Bu protokol, diğer ilgi genleri hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Giriş

Temel genetik düzenleyici unsurları ve onlara hareket faktörleri belirlemek için yeteneği çok sayıda biyolojik süreçlerin keşif için esastır. Bununla birlikte, bu spesifik sinir hücresi popülasyonları gibi nadir hücre tiplerinde gen ekspresyonunu düzenleyen faktörlerin tanımlanması, zor olabilir. Burada, alfa-sinüklein (SNCA) 'nin yeni transkripsiyon düzenleyici belirlenmesi için bir protokol mevcut, Parkinson hastalığı ile ilişkili ve substantianigra dopaminerjik nöronların ifade edilen bir gen, orta beyin bölgesini pars compacta. Biz, 293T hücrelerinde alfa-sinüklein ifade yapısızlaştırmak bir yüksek verimli, çift-lusiferaz, in vitro raportör ekran kullanarak bunu. Alfa-sinüklein promoter birinci ateşböceği lusiferaz geni ihtiva eden bir raportör plazmid içine klonlanır. Yapısal olarak aktif bir promotörün kontrolü altında Renilla lusiferaz içeren bir plazmid, bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. These raportör yapılan, her biri de tek bir kütüphane bir plazmid ile transfekte edilir, öyle ki, bir DNA sentezleme kütüphanesinden plazmidleri ile mikroplakalarda 293T hücrelerine ko-transfekte edilir. 48 saat sonra, her bir muhabir için lusiferaz aktivitesi, bir çift ışıma analizi kullanılarak ardışık olarak ölçülür sonra. Plaka bazlı normale döndükten sonra (R oranı F) her bir Renilla lusiferaz aktivitesi: Her kitaplık genine karşılık olarak alfa-sinüklein nispi ekspresyon böceği oranı ile anlaşılmaktadır.

Bu protokol, insan gücü minimum (1-2 kişi) ve minimum maliyet (mikro-deney başına yaklaşık 3 $ maliyeti reaktifi) kullanılarak, raportör gen transaktivasyonu için kapasiteleri için genleri, çok sayıda (~ haftada 2500) taranması için olanağı sağlar. Genetik manipülasyon dirençli kültüre edilmiş nöronlarda çalışma zordur nöronal genlerin transkripsiyonel düzenleyici (örneğin, alfa-sinüklein), bu doğrudan fonksiyonel deneyde yan yana karşılaştırılabilir. Biz dahil bizimprotokolünün geleneksel prosedürler (Tartışma) ile yetiştirilen bu bölgeyi içeren plazmidler kararsız olduğu bulundu beri klonlama ve alfa-sinüklein promotörünü içeren plazmidlerin büyümesi için ayrıntılı bir yöntem. Ayrıca, yüksek verimli deneyler için ticari olarak temin edilebilen çift-lusiferaz reaktifler için ucuz bir alternatifi bulunmaktadır. Bu protokol, kolayca ilgili diğer düzenleyici elemanları, ya da yüksek verimli, geçici nakiller gerektiren herhangi bir işlem hedeflemek için adapte edilebilir.

Protokol

Deneysel bir bakış için Şekil 1'e bakınız.

1.. Alpha-Sinükleinin Destekleyici İçeren Reporter Plazmidleri hazırlayın

Alfa-sinüklein geni (Şekil 2) Düzenleyici elemanlar intron 2 ³ boyunca yukan NACP (amiloid peptidinin non-A beta bileşen) dinükleotid sekansı tekrar ^1,2 yaklaşık 10 kb, kapsar. Biz, bu bölgenin bir kısmını içerir Bizim muhabir yapı. Biz büyüme için gerekli olan 2 özel prosedürler intron içeren plazmidler, aşağıda özetlenen bulundu. Lusiferaz plazmidleri pGL4.10 ve pGL4.75 (Şekil 3), Promega'dan ticari olarak mevcuttur ve geleneksel moleküler biyoloji protokoller kullanılarak çoğaltılabilir.

1. Tablo 1 'de tarif ve Tablo 2'deki primerler kullanılarak, ayrı PCR reaksiyonlarında alfa-sinüklein promoterin 2 bileşeni yükseltin.
2. Verify PCR TE (Tris-EDTA), 50 ul sulandırarak Qiaquick PCR Saflaştırma kiti (Qiagen) kullanılarak agaroz jel ve clean ürünleri. Gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de taşınan 0.9 kb fragmanı saklayın.
3. SacI ve XhoI ile tüm 3.4 kb PCR fragmanı ses, hem de pGL4.10 5 ug Digest. Buzağı Bağırsağı Alkalin Fosfataz (Roche) ile vektör tedavi ve jel PureLink Quick Jel Özümleme kiti (Invitrogen) kullanılarak saflaştırılması.
4. T4 DNA ligaz (NEB) kullanılarak fragmanı ve vektör Arter. 10 ul TE tampon maddesi içinde yıkanarak PureLink Micro PCR kiti (Invitrogen) kullanılarak, reaksiyonun tamamlandığını temizleyin.
5. ElectroMAX Stbl4 yetkili hücreleri (Invitrogen) içinde 20 ul içine temizlenmiş, bağlama reaksiyonunun 2 ul Dönüşümü ve üreticinin talimatlarına göre elektroporasyona. 90 dakika boyunca 225 rpm'de 30 ° C kuluçka makinesi içinde çalkalayın. 100 mg / ml ampisilin ihtiva eden LB plakaları üzerine yayıldı 2 birimleri ve 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
6. Bir kürdan kullanarak, TB 2 ml (Müthiş Broth) içine aşılama için 4-6 küçük koloniler seçmek. Bir 30 ° C çalkalama O / N, bu miniprep kültürleri büyümek
7. PureLink HiPure Plasmid Miniprep kiti (Invitrogen) kullanılarak her bir miniprep kültürün 1.5 ml plazmid DNA arındırın.
8. BamHI ile miniprepleri sindirimi ve bir agaroz jeli üzerinde electrophorese. Doğru bir klon 2.8 kb ve 4.9 kb'lik fragmanları üretmek gerekir.
9. Taze LB (Luria Et suyu) plakası üzerinde doğru klonundan geri kalan miniprep kültür Restreak ve 2 gün boyunca 30 ° C'de büyür.
10. Küçük bir koloni seçin ve 1.5 ml TB starter kültür aşılamak. 30 ° C'de O / N sallamak Starter kültür doygunluk büyümesine izin vermeyin.
11. Önceden ısıtılmış 150 ml TB içine tüm başlatıcı kültür seyreltilir ve 2 gün boyunca 30 ° C'de çalkalanır. Bir sonraki adıma geçmeden önce, klon replicati sırasında mutasyona olmadığını teyit etmek için ek bir miniprepi ve sindirim için bu kültürün 1.5 ml kullanın üzerinde.
12. PureLink HiPure Plasmid Maksiprep kiti (Invitrogen) kullanılarak geri kalan kültürden plazmid DNA arındırın. Bu ara plazmidin beklenen sonuçlar, kültür, 150 ml başına 50-150 ug bulunmaktadır.
13. Aşama 1.2 'de dondurulmuş 0.9 kb fragmanı çözülme. 1,3-1,12 Kpnl ve Sacl ile sindirim yerine, ara plazmid içine 0.9 kb fragmanının klonlanması için adımları tekrarlayın. Ligatı, seçin, dönüşümü, ve yukarıdaki gibi maksi için büyür. BamHI ile sindirimi 5.8 kb ve 2.8 kb fragmanlarının verim gerekir. Bu ekran için kullanılacak olan bir plazmiddir.

2. Tarama için 293T Hücreler, Muhabir Plazmidleri ve Kütüphane DNA hazırlayın

293T hücreleri ilk olarak 96 oyuklu plakalara tohumlandı ve sonraki gün transfekte edilir. Reporter plazmid ve kütüphane DNA'lar, 96 oyuklu plakalar içinde seyreltilir. Biz Massachusetts General Hospital (en DNA Çekirdek transfeksiyon dereceli kütüphane DNA plakaları elde= "_blank" olsun> dnacore.mgh.harvard.edu). Bu protokol, 293T hücreleri 2 aynı plakalar (Şekil 1) içine tek bir kütüphane plaka transfects hücre böylece 2 plakaları taranabilir her kütüphane levha için ekildi olmalıdır.

Not: Bu lusiferaz deneyleri müdahale ve sırasıyla transfeksiyonla sırasında toksisite arttıkça, kırmızı ya da antibiyotikler fenol olmadan medya hücreleri büyümek.

1. Her kitaplık levha% 14 FBS ihtiva eden DMEM içinde 1.5 x 10 ⁵ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar, tekrar süspansiyon tripsinize edilmiş 293T hücrelerinin taranması için. Steril bir rezervuar (Axygen) dökün.
2. Robot güverte rezervuarı, 2, berrak tabanlı, 96 oyuklu plakaları (Corning), ve filtre pipet uçları bir kutu (Agilent) yerleştirin. Oyuk başına 1.5 x 10 ⁴ hücre yoğunluğunda için, her ikisi de plakaların her kuyuya 100 ul hücre dağıtın.
3. Eşit sağlamak için düşük rampa hızları kullanılarak, 2 dakika boyunca 50 xg'de hücre plakaları santrifüjboyunca her bir hücre yoğunluğu. 37 ° C'de inkübe edilir ve% 10 _CO2 O / N.
4. Serumsuz ortam içinde 5 ng / ul ateş böceği ve Renilla raportör plasmidleri seyreltin. Bir 15 ml konik bir tüp içinde (hacimce) firefly Renilla plazmaya 05:03 oranında bir dilüsyonları birleştirin.
5. Her kuyuya, kütüphane plaka başına 17 ul artı 2-10 ul fazlalık dağıtma, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna pipetle birleşik plasmidler.
6. Yukarıdaki gibi transfeksiyon dereceli DNA kütüphanesi plakaları elde edilir ve endotoksin içermeyen su ile 13.3 ng / ul seyreltin. Oyuk başına asgari hacmi 28 ul olmalıdır.

3.. Transfeksiyonlar gerçekleştirin

Ekranın 2. günde, raportör plasmidleri ve kütüphane DNA'lar 293T hücrelerine transfekte edilir.

1. Her bir plaka için kütüphane, bir polistiren bir tüp içinde 4.3 ml serum barındırmayan ortam (1:40 seyreltme) ile RT Optifect (Invitrogen) 107.5 ul karıştırın. 5 dakika oda sıcaklığında ve inküben, 96 oyuklu, polistiren V-tabanlı bir plakanın (Greiner) her oyuğuna (kütüphane plaka başına) 44 ul dağıtmak.
2. Seyreltilmiş Optifect tabak, raportör plasmidleri (Aşama 2.5), kütüphane DNA'lar (Aşama 2.6) ve robot güverte pipet uçları bir kutu yerleştirin.
3. Her aspirasyon arasında 5 ul hava boşluğu ekleme muhabiri plazmidler, seyreltilmiş Optifect 43 ul, ve kütüphane DNA 26 ul, aspire 17 ul. Kütüphane DNA çapraz bulaşmayı önlemek için son aspire edilmelidir. Yeni bir polistiren V-altlı plaka içine ipuçları içeriğini dağıtın, kapak karıştırın ve lipid / DNA kompleksleri oluşturmak için izin vermek için 20 dakika boyunca bir kenara ayrılmıştır. Birden çok kütüphane plakaları transfecting ise pipet ipuçları ve kütüphane plakasını değiştirin ve tekrarlayın.
4. Optifect / DNA karışımı, plaka ortaya çıkarmak ve 293T hücrelerinde 2 plakaları ile robot güverte üzerine yerleştirin. Pipet ipuçları tek bir kutu, aspire Optifect 80 ul Kullanımı: DNA karışımı ve yavaş yavaş hücrelerin her levha üzerine 40 ul dağıtmak. Trans eğerbirden çok kütüphane plakaları edilmesini, tüm Optifect için tekrarlayın: DNA plakaları. Hücreleri kapsayacak.
5. 30 dakika boyunca 1200 x g'de hücre plakaları santrifüjleyin. Kapak ve inkübatör dönmek.
6. 4-6 saat boyunca hücrelerin inkübe edin. Bu kuluçka sırasında, her bir plaka için transfekte edilmiş kitaplık,% 10 FBS ve 10 ug / ml siprofloksasin (Cellgro) içeren 12 ml DMEM karıştırılmasıyla taze ortam hazırlar. Steril bir rezervuar içine taze medya dökün.
7. Robot ipuçları 2 kutu yerleştirin, hücrelerin tek bir tabak, robot güverteye taze medya ve atık haznesi içeren rezervuar. Aspire 100 hücrelerden ortam ul ve kısmen de% 70 etanol ile doldurulmuş atık rezervuar içine dağıtın. Taze ipuçları, taze medya aspire 100 ul kullanarak ve yavaş yavaş hücreleri üzerine dağıtmak. Bütün hücre plakaları için tekrarlayın.
8. 48 saat boyunca inkübatör plakaları dönün.

4.. Dual-Lusiferaz Deneyleri gerçekleştirme

Ekranın 4. günde,ateşböceği ve Renilla lusiferaz tahlilleri gerçekleştirilir.

Not:. Tablo 3 'de tarif edildiği gibi, çift-lusiferaz deney Firefly ve Renilla lusiferazların böylece hücreler önce lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi için lize olmalıdır salgılanmış olmamak üzere, 2 deney tampon maddeleri, ateş böceği 3X deney tamponu ve 3X Renilla deney tamponu ardışık olarak ilave edilmesini gerektirir . Firefly deney tamponu hücreleri lize ve ateş böceği lusiferaz alt-tabaka içerir; Renilla deney tamponu ateşböceği sinyali söndürür ve Renilla lusiferaz alt-tabaka üretmektedir.

1. Tablo 3 'de tarif edildiği gibi her bir kitaplık plaka için, stok çözeltilerinden 3X firefly deney tamponu içinde 8 ml hazırlamak ve bir 96 oyuklu V-tabanlı bir plakanın her oyuğuna 82 ul dağıtmak.
2. Her bir kütüphane için plaka, aynı zamanda 3X Renilla deney tamponu içinde 12 ml hazırlamak ve bir 96 oyuklu V-tabanlı bir plakanın her oyuğuna 122 ul dağıtmak. Her iki kenara koyunateşböceği ve Renilla tahlil tamponlar.
3. Robot Güvertede (aynı kütüphane plakadan nakledilen) pipetle ipuçları bir kutu, bir atık rezervuar, ve hücrelerin 2 tabak yerleştirin.
4. Aspire 60 Her levhadan ortam ul ve kısmen de% 70 etanol ile doldurulmuş atık haznesinde atın. Kenara kapak plakaları ve ayarlayın. Birden çok kütüphane plakaları transfecting ise, plakaların tüm setleri için tekrarlayın.
5. 2 pipet ipuçları kutuları, 3X ateşböceği tahlil tampon plaka, ve robot güvertede hücre plakaları bir dizi yerleştirin.
6. Aspire 40 3X firefly ul deney tamponu ve iyice karıştırma, hücrelerin birinci plaka ekleyin. Yeni pipetlemeyin ipuçları geçiş, ikinci hücre plaka için tekrarlayın. Lizizi tamamlamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreler yerleştirin. Birden çok kütüphane plakaları transfecting varsa, ipuçları ve hücre plakaların kutuları değiştirin ve tekrarlayın.
7. Her hücre 1 saniye kayıt bir lüminometre üzerinde plaka, başına iyi her kuyudan rekor lüminesans. Robot plakaları geri döngüverte.
8. 2 pipet uçları kasası, 3X Renilla deney tamponu plaka ve robot güverte hücre plakaları bir dizi yerleştirin.
9. Aspire 60 3X Renilla ul deney tamponu ve iyice karıştırma, hücrelerin birinci plaka ekleyin. Pipet ipuçları yeni bir kutuya geçiş, ikinci hücre plaka için tekrarlayın. Birden çok kütüphane plakaları transfekte ise, hücre plakalar her kümeleri için tekrarlayın.
10. Yukarıdaki gibi 1 saniye Her çukurun kayıt bir lüminometre tüm plakaları Tutanak lüminesans. Plakaları atın.

5. Veri Analizi

1. Ateşböceği hesaplayın: Renilla lüminesans oranını ("F: R oranı"), Renilla sinyalin sayımlarının böceği sinyalinin sayımları bölünerek her bir oyuk için.
2. F bölerek indüksiyon değerini hesaplayın: iyi ortalama F tarafından her R oranı: plakasının R oranı, kuyuların en yüksek ve en düşük% 25 hariç.
3. Çoğaltır genelinde indüksiyon değerleri ortalamasınıTek bir transfekte edilmiş kitaplık levha. Üç kat daha alfa-sinüklein daha uyaran veya bastıran genleri Bu ekranda "hit" olarak kabul edilir ve daha fazla doğrulama ve ikincil ekranları tabidir.

Sonuçlar

Tipik Lusiferaz değerleri, K: R, oranlar ve tek bir yarım plaka için indüksiyon değerleri Şekil 4'te gösterilmiştir iyi H2, bir 32-kat indükleyici olarak isabet not edin.. Aşırı toksisite (örneğin, iyi E3), ya da kötü transfekte edildi kuyuları neden olan genler, hem ateşböceği ve Renilla lusiferazlarm düşük değerler üretmek, ama ortalama bir indüksiyon değer olacaktır. PGL4 omurgası ile etkileşim yoluyla olabilir lusiferaz aktivitesi, non-spesifik ind...

Tartışmalar

Alfa-sinüklein Lewy ^4, bu hastalık için patognomonik olarak hücre içi dahil olanlar bir bileşeni olarak, Parkinson hastalığı (PD) olarak işaret edilmiştir. Çok sayıda genom-geniş dernek çalışmaları sporadik PH ^5,6,7 riski ile alfa-sinüklin tek nükleotid polimorfizmleri bağlantılı var. Sporadik PH daha az yaygın olsa da, ailesel PD aynı zamanda çoğaltılması ve alfa-sinüklein mahalinin ^9,10,11 arasında triplication olarak, alfa-sinüklin ⁸ mutasyon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
			Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
Coenzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003