집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

요약

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

초록

우리는 α-시누 클레인 파킨슨 질환과 관련된 유전자의 전사 레귤레이터를 식별하기 위해 신속하고 저렴하게 높은 처리량 선별 프로토콜을 제시한다. 293T 세포는 일시적으로 한 유전자 당 잘 마이크로 포맷, 함께 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로, 배열 ORF 식 라이브러리에서 플라스미드로 형질됩니다. 반딧불 루시 페라 제 활동은 내부 통제 구조 (레 닐라 루시퍼를 연출 HCMV 프로모터)의 표현에 표준화 된 알파 synuclein의 전사,시 각 라이브러리 유전자의 효과를 결정하기 위해 48 시간 후 정량된다. 이 프로토콜은 96 - 웰 형식으로 무균 액체 처리를 수행하는 생물 안전 캐비닛에 동봉 된 벤치 탑 로봇에 의해 촉진된다. 우리의 자동화 된 형질 전환 프로토콜은 높은 처리량 렌티 바이러스 라이브러리 생산 conju 고유 라이브러리 플라스미드 많은 수의 트리플 형질을 필요로하는 다른 기능 검사 프로토콜에 쉽게 적응할 수있다도우미 플라스미드의 일반적인 세​​트 nction. 우리는 또한 저렴하고 검증 된 대안을 제시 PTC124, EDTA, 사전 레 닐라 루시퍼의 측정에 반딧불 루시 페라 제의 활동을 억제하는 피로 인산을 사용 시판, 이중 루시퍼 라제 시약을합니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 검사 및 알파 synuclein의 68 레귤레이터을 확인했다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

서문

키 유전자 규제 요소와 그들에 작용하는 요소를 식별 할 수있는 능력은 다양한 생물학적 과정의 탐사를 위해 필수적입니다. 그러나, 특정 신경 세포의 집단으로 희귀 한 종류의 세포에서 유전자의 발현을 조절 요소를 식별, 도전하실 수 있습니다. 여기서, 우리는 α-시누 클레인 (SNCA)의 신규 한 전사 레귤레이터를 식별하기위한 프로토콜을 제시, 파킨슨 질환과 연관 substantianigra에서 도파민 뉴런에서 발현 유전자의 중뇌 compacta 영역 모양체. 우리는 293T 세포에서 α-시누 클레인의 발현을 재조하기 위해 높은 처리량, 이중 - 루시퍼 라제, 시험 관내 리포터 스크린을 사용하여이를 달성. 알파 synuclein 촉진제 우선 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드로 클로닝된다. 구성 적으로 활성화 된 프로모터의 조절하에 레 닐라 루시퍼 라제를 함유하는 시판되는 플라스미드는 내부 제어로서 기능한다. 살전E 기자의 구조는 각이 잘 단일 라이브러리 플라스미드로 형질되도록, DNA 발현 라이브러리에서 플라스미드와 마이크로 플레이트에 293T 세포에 공동 형질 전환됩니다. 48 시간, 각 리포터 대해 루시퍼 라제 활성을 듀얼 글로우 분석을 사용하여 순차적으로 측정 한 결과. 플레이트 기반 정상화 : (R 비율 F) 각 잘 레 닐라 루시퍼 활동 : 각 라이브러리 유전자에 대한 응답으로 알파 synuclein의 상대적 발현 반딧불의 비율로 유추됩니다.

이 프로토콜은 최소한의 인력 (1-2 명) 및 최소 비용 (마이크로 분석 당 약 3달러 시약 비용)를 사용하여 리포터 유전자를 전사 할 수있는 능력에 대한 유전자의 다수 (~ 주당 2,500)를 선별하는 기능을 제공한다. 유전자 조작에 불응 배양 신경 세포에서 공부하기 어려운 신경 세포의 유전자의 전사 규제 (예를 들어, 알파 - 시누 클레인)은,이 직접 기능 분석에서 나란히 비교 될 수있다. 우리는 우리에 포함프로토콜 우리가 통상적 인 방법 (토론 참조) 재배 할 때이 영역을 포함하는 플라스미드가 불안정한 것을 발견 이후 복제 및 α-synuclein의 프로모터를 포함하는 플라스미드의 성장을위한 자세한 방법. 우리는 또한 높은 처리량 분석을위한 상용 듀얼 루시퍼 라제 시약에 대한 저렴한 대안이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 관심의 다른 규정 요소를, 또는 높은 처리량 과도 형질을 필요로하는 프로세스에 대상으로 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

실험 개요는 그림 1을 참조하십시오.

1. 알파 synuclein 발기인을 포함하는 리포터 플라스미드를 준비

알파 synuclein 유전자 (그림 2)의 규정 요소는 인트론 2 ^{~ 3} 상류 NACP (아밀로이드 펩티드의 비 베타 구성 요소) 디 뉴클레오티드 반복 서열 ^1,2에서 대략 10 킬로바이트, 스팬. 우리는이 지역의 일부를 포함 우리 기자의 구조. 우리는 성장이 필요한 특별한 절차 인트론 포함하는 플라스미드는, 아래에 설명 된대로 나타났습니다. 루시퍼 라제 플라스미드, pGL4.10 및 pGL4.75 (도 3), Promega 사에서 시판하고 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 전달 될 ​​수있다.

1. 표 1의 제조법과 표 2의 프라이머를 사용한 PCR을 별도의 알파 synuclein 촉진제의 2 성분을 증폭한다.
2. VERI기 PCR의 TE (트리스-EDTA)의 50 μL의 용출, 제품, QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가 로스 젤 및 청소에 제품. 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 용출 0.9 KB 조각을 저장합니다.
3. 를 SacI 및 XhoI에, 전체 3.4 킬로바이트 PCR 단편의 양뿐만 아니라 pGL4.10 5 μg 다이제스트. 송아지 소장 알칼리 포스 파타 아제 (로슈)와 벡터를 처리하고 젤 PureLink의 빠른 젤 추출 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 정제.
4. T4의 DNA 리가 제 (NEB)을 사용하여 단편 및 벡터를 결찰. 10 ㎕의 TE 버퍼에 용출 PureLink의 PCR 마이크로 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 완성 된 반응을 청소합니다.
5. ElectroMAX Stbl4 능력 세포 (Invitrogen 사) 20 ㎕로 청소 연결 반응의 2 μl를 변환하고, 제조업체의 지침에 따라 electroporate. 90 분 동안 225 rpm에서 30 ° C의 배양기에서 흔들어. 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트에 2 볼륨을 확산하고 2 일 동안 30 ° C에서 알을 품다.
6. 이쑤시개를 사용하여, TB 2 ㎖ (좋아요 국물)에 접종 4-6 작은 식민지를 선택합니다. 30 ° C의 셰이커 O / N. 이러한 미니 프렙 문화를 성장
7. PureLink의 HiPure 플라스미드 미니 프렙 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 각각의 미니 프렙 배양 1.5 밀리리터부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다.
8. 을 BamHI과 minipreps을 소화하고 아가 로스 젤에 electrophorese. 올바른 클론 2.8 KB 4.9 KB의 조각을 생성한다.
9. 신선한 LB (루리아 국물) 판의 정확한 복제에 남아있는 미니 프렙 문화를 Restreak 2 일 동안 30 ° C에서 성장한다.
10. 작은 식민지를 선택하고 1.5 ML의 TB 스타터 문화를 접종. 30 ° C에서 O / N을 흔들어 스타터 문화가 포화 성장하게하지 마십시오.
11. 데워진 TB 150 ㎖로 전체 스타터 문화를 희석하고 2 일 동안 30 ° C에서 흔들. 다음 단계로 진행하기 전에 복제가 replicati 중에 변형되지 않았 음을 확인하기 위해 추가로 미니 프렙 소화이 문화의 1.5 ML를 사용 에.
12. PureLink의 HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 나머지 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. 이 중간 플라스미드의 예상 수익률은 문화 150 ㎖ 당 50 ~ 150 μg이다.
13. 단계 1.2에 얼어 0.9 KB 조각을 해동. 1.3 1.12에이를 KpnI 및 SacI로와 대신 소화, 중간 플라스미드에 0.9 KB 조각을 복제하는 단계를 반복합니다. 결찰, 선택, 변환, 상기와 같이 maxipreps에 성장. 을 BamHI로 소화 5.8 킬로바이트 및 2.8 킬로바이트의 조각을 얻을 수 있어야합니다. 이는 화면에 사용될 플라스미드이다.

2. 심사 293T 세포, 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 준비

293T 세포는 처음 96 - 웰 플레이트에 접종하고 다음 날 형질 전환됩니다. 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 96 - 웰 플레이트에 희석된다. 우리는 매사추세츠 종합 병원 (Massachusetts General Hospital에서 DNA 코어에서 형질 급 라이브러리 DNA의 판을 얻​​을= "_blank"를 얻을> dnacore.mgh.harvard.edu). 이 프로토콜은 293T 세포의 동일한 2 판 (그림 1)에 하나의 라이브러리 판을 transfects, 세포 따라서 2 판을 상영하는 각 라이브러리 플레이트에 접종해야한다.

참고 :이 루시 페라 제 분석에 방해가 각각 형질 동안 독성을 증가로, 빨간색 또는 항생제 페놀없이 미디어의 세포를 성장.

1. 각 라이브러리 플레이트를 14 % FBS를 함유하는 DMEM에 1.5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 농도로 재현 탁 트립신 293T 세포를 상영하는. 멸균 저수지 (Axygen)에 붓는다.
2. 로봇 갑판에 저장, 2 명확한 바닥, 96 - 웰 플레이트 (코닝), 및 필터 피펫 팁의 상자 (애질런트)를 놓습니다. 물론 당 1.5 × 10 ⁴ 세포의 밀도, 두 플레이트의 각 웰에 세포를 100 μl를 분배.
3. 동등한 있도록 낮은 램프 속도를 사용하여, 2 분간 50 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기각 웰에 걸쳐 세포 밀도. 37 품어 ° C와 10 %의 CO ₂ O / N.
4. 혈청이없는 배지에서 5 NG / μL로 개똥 벌레와 레 닐라 기자 플라스미드를 희석. 15 ML 원뿔 튜브 (부피 기준) 반딧불 레 닐라 플라스미드에 5:3 비율로 희석을 결합합니다.
5. 각 웰에, 도서관 접시 당 17 μL, 플러스 2-10 μL 과잉 분배 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 피펫은 결합 플라스미드.
6. 위와 같이 형질 등급 DNA 라이브러리 판을 확보하고 독소가없는 물 33.9 NG / μL로 희석. 물론 당 최소 부피는 28 ㎕를해야한다.

3. 형질을 수행

화면의 2 일에서 기자 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 293T 세포에 형질 전환됩니다.

1. 각 라이브러리 플레이트를 들어, 폴리스티렌 튜브에 4.3 ㎖의 혈청이없는 미디어 (1시 40분 희석)와 RT Optifect (인비 트 로젠)의 107.5 μl를 섞는다. 5 RT에서 분, 그리고 알을 품다N 96 - 웰, 폴리스티렌 V-바닥 플레이트 (그레이 너)의 각 웰에 (라이브러리 판 기준) 44 μl를 분배.
2. 희석 Optifect의 플레이트, 기자 플라스미드 (단계 2.5), 라이브러리의 DNA (단계 2.6), 로봇 갑판에 피펫 팁 상자를 놓습니다.
3. 각각의 열망 사이의 5 μL의 에어 갭을 삽입 기자 플라스미드, 희석 Optifect 43 μL, 도서관 DNA의 26 μL의 17 μL를 대기음. 라이브러리 DNA 교차 오염을 방지하기 위해 마지막으로 발음해야한다. 새로운 폴리스티렌 V 바닥 판에 팁의 내용을 분배, 커버를 혼합, 지질 / DNA 복합체를 형성 할 수 있도록 20 분 동안 방치. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 피펫 팁 및 라이브러리 판을 교체하고 반복합니다.
4. Optifect / DNA 혼합물 판을 발견하고 293T 세포의 2 판에 로봇 갑판에 놓습니다. 피펫 팁의 하나의 상자, 대기음 Optifect의 80 μl를 사용 : DNA 혼합물을 천천히 세포의 각 판에 40 μl를 분배. 트랜스 경우여러 라이브러리 판을 fecting, 모든 Optifect를 반복 : DNA 플레이트. 세포를 커버.
5. 30 분 동안 1,200 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기. 커버 및 인큐베이터로 돌아갑니다.
6. 4-6 시간 동안 세포를 품어. 이 부화하는 동안, 각 형질 라이브러리 판에 10 % FBS 및 10 ㎍ / ㎖의 시프로플록사신 (CellGro)를 포함하는 12 ML의 DMEM을 혼합하여 새로운 미디어를 준비합니다. 멸균 저수지에 신선한 미디어를 붓는다.
7. 로봇 팁이 상자를 놓고 세포의 단판, 로봇 데크로 신선한 미디어, 폐기물 저장조를 포함하는 저장조. 대기음 100 세포에서 미디어 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 분배. 신선한 팁, 새로운 미디어의 대기음 100 μl를 사용하여 천천히 세포에 분배. 세포의 모든 판에 대해 반복합니다.
8. 48 시간 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.

4. 듀얼 루시 페라 제 분석 실험을 수행

화면의 4 일에,개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 분석이 수행된다.

주 :. 표 3에 설명 된 것처럼 이중 루시퍼 라제 분석은 개똥 벌레 및 레 닐라 luciferases은 따라서 세포가 이전에 루시페라아제 활성을 측정에 용해되어야 분비되지 않으며,이 분석 완충제, 3X 반디 분석 완충액 및 3X 레 닐라 분석 완충액의 순차 첨가를 필요 . 반딧불 분석 버퍼 세포를 lyses과 반딧불 루시 페라 제를위한 기판을 제공 레 닐라 분석 버퍼는 반딧불 신호를 꺼 버리는와 레 닐라 루시퍼를위한 기판을 제공한다.

1. 표 3에 설명 된대로 각 라이브러리 판의 경우, 원액의 3 배 개똥 벌레 분석 버퍼 8 ㎖를 준비하고, 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 82 μl를 분배.
2. 각 라이브러리 판의 경우에도 3 배 레 닐라 분석 버퍼의 12 ML을 준비하고 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 122 μl를 분배. 양 옆으로 설정개똥 벌레와 레 닐라 분석 버퍼.
3. 로봇 갑판에 (같은 라이브러리 판에서 형질) 피펫 팁 상자, 폐기물 저장 및 셀의 2 판을 놓습니다.
4. 대기음 60 각 판의 용지 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 버린다. 옆 커버 플레이트 및 설정합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 플레이트의 모든 세트를 반복합니다.
5. 2 피펫 팁 상자, 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다.
6. 대기음 40 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 μL하고 철저하게 혼합, 세포의 제 1 판에 추가합니다. 새로운 피펫 팁으로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 용해를 완료하는 데 10 분 동안 실온에서 세포를 놓습니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 팁, 세포 판의 상자를 교체하고 반복합니다.
7. 각 셀의 1 초 동안 기록 루미 접시, 당 우물의 각 우물에서 기록 발광. 로봇에 번호판을 반환갑판.
8. 2 피펫 팁 상자, 배 레 닐라 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다.
9. 대기음 60 3X 레 닐라 분석 완충액의 μL, 철저히 혼합, 세포의 제 1 플레이트에 추가한다. 피펫 팁의 새로운 상자로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 전지 판의 모든 세트를 반복합니다.
10. 위와 같이 1 초 동안 각 웰을 기록 루미의 모든 플레이트에서 기록 발광. 번호판을 폐기하십시오.

5. 데이터 분석

1. 개똥 벌레를 계산 레 닐라 발광 비율 ( "F : R 비율") 레 닐라 신호의 개수에 의해 반딧불 신호의 수를 분할하여 각 웰에 대한.
2. F 나누어 유도 값을 계산 : 잘 평균 F로 각각의 R 비율 : 판의 R 비율, 우물의 최고 및 최저 25 %를 제외합니다.
3. 반복 실험을 통해 유도 값을 평균하나의 형질 라이브러리 플레이트. 세 겹 이상의 알파 synuclein 더 유도하거나 억압 유전자는이 화면에서 "히트"으로 간주하고, 검증 및 보조 화면에 근거합니다.

결과

일반 루시퍼 값, F : R의 비율과 하나의 하프 플레이트 유도 값을 그림 4에 나타내었다 아니라 H2, 32 배 유도에 타격을합니다.. 과도한 독성 (예를 들어, 잘 E3), 또는 가난하게 형질 전환 된 우물을 일으키는 유전자는 모두 개똥 벌레와 레 닐라 luciferases 낮은 값을 생성하지만, 평균 유도 값이됩니다. pGL4 백본과의 상호 작용을 통해, 아마도 루시퍼 라제 활성의 비특이적 유도?...

토론

알파 - 시누 클레인은 루이 기관 ^4, 질병에 대한 pathognomonic 고려 세포 흠의 구성 요소로 파킨슨 병 (PD)에 연루되어있다. 수많은 게놈 넓은 협회 연구는 산발적 PD ^5,6,7에 대한 위험 증가와 알파 synuclein의 단일 염기 다형성을 연결했다. 산발적 PD보다 일반적인 있지만, 가족 PD는 또한뿐만 아니라 복제 및 α-synuclein의 궤적 ^9,10,11의 삼배로, 알파 synuclein ⁸ 돌연변이에 의해...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
			Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
Coenzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003