Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Zusammenfassung

Wir stellen eine schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screening-Protokoll zur Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein-Gen mit einer Parkinson-Krankheit zu identifizieren. 293T-Zellen transient mit Plasmiden aus einem Array ORF Expressionsbibliothek transfiziert zusammen mit Luciferase-Reporter-Plasmide, in einem Ein-Gen-per-Well-Mikroformat. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird nach 48 Stunden, um die Wirkungen von jeder Bibliothek Gen auf alpha-Synuclein-Transkription, normiert auf die Expression von einer internen Kontrollkonstrukt (hCMV-Promotor, eine Renilla-Luciferase) zu bestimmen, untersucht. Dieses Protokoll wird von einer Bank-Top-Roboter in einer Biosicherheitsschrank eingeschlossen, die aseptische Handhabung von Flüssigkeiten in 96-Well-Format führt erleichtert. Unsere automatisierten Transfektionsprotokolls ist leicht an Hochdurchsatz-Bibliothek lentivirale Produktion oder andere funktionelle Screening-Protokolle Triple-Transfektionen von einer großen Anzahl von einzigartigen Bibliothek Plasmide in konjugierte erfordernnktion mit einem gemeinsamen Satz von Helfer-Plasmide. Wir stellen auch eine kostengünstige und validiert Alternative zu handelsüblichen, Dual-Luciferase-Reagenzien, PTC124, EDTA und Pyrophosphat Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität vor der Messung der Renilla-Luciferase verwendet drücken. Mit Hilfe dieser Methoden, abgeschirmt wir 7670 menschliche Gene identifiziert und 68 Regulatoren der alpha-Synuclein. Dieses Protokoll ist leicht modifizierbar, um andere Gene von Interesse abzielen.

Einleitung

Die Fähigkeit, wichtige genetische Regulationselemente und die Faktoren, die auf sie einwirken zu identifizieren, ist für die Exploration von zahlreichen biologischen Prozessen fundamental. Jedoch Faktoren zu identifizieren, die die Expression von Genen in seltenen Zelltypen regulieren, wie spezifische neuronale Populationen, kann schwierig sein. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von neuartigen Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein (SNCA) präsentieren wir ein Gen, das mit der Parkinson-Krankheit und der dopaminergen Neuronen in der substantianigra ausgedrückt pars compacta Bereich des Mittelhirns. Wir erreichen dies mit einem Hochdurchsatz-, Dual-Luciferase, in-vitro-Reporter Bildschirm, um Alpha-Synuclein-Expression in 293T-Zellen zu dekonstruieren. Die alpha-Synuclein-Promotor wird zunächst in einem Reporterplasmid, das den Glühwürmchen-Luciferase-Gen kloniert. Ein handelsübliches Plasmid, das das Renilla-Luciferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors dient als interne Kontrolle. These-Reporter-Konstrukte in 293T-Zellen cotransfiziert in Mikrotiterplatten mit Plasmiden aus einer DNA-Expressionsbibliothek, so dass jede Vertiefung mit einer einzigen Bibliothek transfiziert. Nach 48 Stunden Luciferase-Aktivität für jeden Reporter sequentiell unter Verwendung eines Dual-Schein-Assay gemessen. Renilla-Luciferase-Aktivität in jeder Vertiefung (F: R-Verhältnis) nach der Plattenbasis Normalisierung der relativen Expression von alpha-Synuclein in Reaktion auf jede Bibliothek Gen wird durch das Verhältnis von Glühwürmchen abgeleitet.

Dieses Protokoll stellt die Fähigkeit, eine große Anzahl von Genen (~ 2.500 pro Woche) auf ihre Fähigkeit, ein Reportergen zu trans Verwendung minimaler Arbeitskraft (1-2 Personen) und minimalen Kosten (etwa 3 $ Reagenzienkosten pro Mikroassay) zu screenen. Transkriptionsregulatoren der neuronalen Gene (z. B. alpha-Synuclein), die schwierig in kultivierten Neuronen refraktär genetische Manipulation zu studieren, können Seite an Seite in dieser direkten funktionellen Assay verglichen werden. Wir sind in unsererProtokoll eine ausführliche Verfahren für das Klonen und das Wachstum der Plasmide, die das Alpha-Synuclein-Promotor, da wir festgestellt, dass Plasmide, die diese Region instabil sind, wenn sie mit herkömmlichen Verfahren (siehe Diskussion) gewachsen. Wir berücksichtigen auch eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Dual-Luciferase-Reagenzien für die Hochdurchsatz-Assays. Dieses Protokoll kann leicht an andere regulatorische Elemente von Interesse, oder zu jedem Prozess eine hohe Durchsatz transienten Transfektionen Ziel werden.

Protokoll

Für eine experimentelle Übersicht siehe Abbildung 1.

1. Bereiten Reporter Plasmide, die die Alpha-Synuclein Promoter

Regulatorischen Elemente des alpha-Synuclein-Gen (Fig. 2) erstrecken etwa 10 kb, von der stromaufwärts NACP (Nicht-A-beta-Peptid Amyloid-Komponente) ^{1,2-Dinukleotid-Repeat-Sequenz} durch Introns 2 ^3. Wir schließen einen Teil dieser Region unsere Reporter-Konstrukt. Wir fanden, daß Plasmide, die Intron 2 erforderliche spezielle Verfahren für das Wachstum, wie unten beschrieben. Die Luciferase-Plasmiden pGL4.10 und pGL4.75 (Fig. 3), sind im Handel von Promega und kann unter Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Protokollen vermehrt werden.

1. Verstärken die zwei Komponenten des Alpha-Synuclein-Promotor in getrennten PCRs mit dem Rezept in Tabelle 1 und der Primer in Tabelle 2.
2. Verify PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel und sauber unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) unter Elution in 50 &mgr; l TE (Tris-EDTA). Bewahren Sie die eluierten 0,9 kb-Fragment bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung.
3. Verdauen das gesamte Volumen des 3,4 kb PCR-Fragment sowie 5 ug pGL4.10, mit SacI und XhoI. Behandeln Sie den Vektor mit Kalbsdarm-Alkalische Phosphatase (Roche) und Gel reinigen mit dem Purelink Schnell Gel Extraction Kit (Invitrogen).
4. Ligation des Fragments und Vektor Verwendung von T4-DNA-Ligase (NEB). Reinigen Sie das ausgefüllte Reaktion unter Verwendung des Purelink Micro PCR-Kit (Invitrogen) unter Elution in 10 ul TE-Puffer.
5. Transformations 2 ul des gereinigten, Ligation in 20 ul ElectroMAX Stbl4 kompetente Zellen (Invitrogen) und Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schütteln in einem 30 ° C Inkubator bei 225 Upm für 90 min. Verbreiten 2 Volumina auf LB-Platten, die 100 mg / ml Ampicillin und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage.
6. Mit einem Zahnstocher, wählen Sie 4-6 kleine Kolonien für die Impfung in 2 ml TB (Terrific Broth). Wachsen diese Miniprep Kulturen in ein 30 º C-Schüttler O / N.
7. Reinige Plasmid-DNA aus 1,5 ml jeder Kultur Miniprep mit dem Purelink HiPure Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen).
8. Verdauen die Minipräparationen mit BamHI und Elektrophorese auf einem Agarose-Gel. Die richtige Klon sollte Fragmente von 2,8 kb und 4,9 kb zu produzieren.
9. Restreak die verbleibende Miniprep-Kultur von der richtigen Klons auf eine frische LB (Luria Broth)-Platte und wachsen bei 30 ° C für 2 Tage.
10. Wählen Sie einen kleinen Kolonie und impfen 1,5 ml TB Starterkultur. Schütteln Sie O / N bei 30 ° C Lassen Sie sich nicht die Starterkultur zur Sättigung wachsen.
11. Verdünnt das gesamte Starterkultur in 150 ml vorgewärmtem TB und schüttelt bei 30 ° C für 2 Tage. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt, verwenden Sie 1,5 ml dieser Kultur für eine zusätzliche Miniprep und Verdauung zu bestätigen, dass der Klon nicht während replicati mutieren auf.
12. Reinige Plasmid-DNA aus den verbleibenden Kultur mit dem Purelink HiPure Maxiprep Plasmid-Kit (Invitrogen). Erwartete Erträge dieses Zwischen Plasmid sind 50-150 g pro 150 ml der Kultur.
13. Auftauen 0,9 kb-Fragment in Schritt 1.2 eingefroren. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.12, die 0,9 kb-Fragment in die Zwischen Plasmid klonen, zu verdauen, statt mit KpnI und SacI. Ligats, umzuwandeln, wählen Sie, und wachsen für Maxipreps wie oben. Digestion mit BamHI sollten Fragmente von 5,8 kb und 2,8 kb ergeben. Dies ist das Plasmid, das für den Bildschirm verwendet werden.

2. Bereiten 293T-Zellen, Reporter Plasmide und DNA-Bibliothek für Screening

293T-Zellen werden zunächst in 96-Well-Platten transfiziert und am folgenden Tag. Reporter-Plasmide und DNA-Bibliothek werden in 96-Well-Platten verdünnt. Wir erhaltenen Platten der Transfektion-Grade-Bibliothek-DNA aus der DNA-Core am Massachusetts General Hospital (bekommen = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Dieses Protokoll transfiziert eine einzelne Bibliothek Platte in zwei identische Platten von 293T-Zellen (Abbildung 1), sollten also 2 Platten von Zellen für jede Bibliothek Platte abgeschirmt werden ausgesät werden.

Hinweis: Wachsen Zellen in Medium ohne Phenolrot oder Antibiotika, da diese nicht mit den Luciferase-Assays und erhöhen Toxizität während der Transfektion sind.

1. Für jede Bibliothek Platte, resuspendieren trypsiniert 293T Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10 ⁵ Zellen / ml in DMEM, das 14% FBS gescreent werden. Gießen Sie in einen sterilen Behälter (Axygen).
2. Setzen Sie den Behälter, 2 klarem Boden, 96-Well-Platten (Corning) und eine Schachtel Filterpipettenspitzen (Agilent) auf der Roboter-Deck. Verteilen von 100 &mgr; l Zellen in jede Vertiefung der beiden Platten bei einer Dichte von 1,5 x 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung.
3. Zentrifugieren Sie die Zellplatten bei 50 g für 2 min, mit niedrigen Drehzahlen, gleiche Rampe zu gewährleistenZelldichte während jeder gut. Bei 37 ° C und 10% CO ₂ O / N.
4. Verdünnen Sie die Firefly-und Renilla Reporterplasmide bis 5 ng / ul in Serum-freien Medien. Kombinieren der Verdünnungen im Verhältnis 5:3 Glühwürmchen Renilla-Plasmid (das Volumen) in einem 15 ml konischen Röhrchen.
5. Pipettieren die kombinierten Plasmide in jedes Well einer 96-Well-Platte, Abgabe 17 ul pro Bibliotheksplatte plus 2-10 ul Überschuss, in jede Vertiefung.
6. Erhalten Transfektion-Grade-DNA-Bibliothek Platten wie oben und mit Wasser auf 13,3 ng / ul mit Endotoxin-freiem Wasser. Das Mindestvolumen pro Well 28 ul sein sollte.

3. Führen Transfektionen

Am Tag 2 des Bildschirms werden Reporterplasmide und Bibliotheks DNAs in 293T-Zellen transfiziert.

1. Für jede Bibliothek Platte, mischen 107,5 ul RT Optifect (Invitrogen) mit 4,3 ml Serum-freien Medien (1:40-Verdünnung) in einem Polystyrolröhrchen. Inkubation für 5 min bei RT undn verzichten 44 ul (pro Bibliothek Platte) in jedes Well einer 96-Well-, Polystyrol V-Bodenplatte (Greiner).
2. Die Platte des verwässerten Optifect, Reporter-Plasmide (Schritt 2.5), Bibliothek DNAs (Schritt 2.6), und eine Schachtel-Pipettenspitzen auf der Roboterplattform.
3. Saugen Sie 17 ul Reporterplasmide, 43 ul verdünnte Optifect und 26 ul DNA-Bibliothek, Einfügen eines 5 ul Luftspalt zwischen den einzelnen Streben. Die Bibliothek DNA sollte zuletzt angesaugt werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Dispense den Inhalt der Tipps in eine neue Polystyrol V-förmigen Platte, mischen, Deckel, und beiseite stellen für 20 Minuten, damit Lipid / DNA-Komplexe zu bilden. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Pipettenspitzen und Bibliotheksplatte, und wiederholen.
4. Entdecken Sie die Optifect / DNA-Gemisch Platte und legen Sie es auf die Roboterplattform mit 2 Platten von 293T-Zellen. Mit einer einzigen Box von Pipettenspitzen, aspirieren 80 ul der Optifect: DNA-Gemisch und langsam 40 ul verzichten auf jede Platte von Zellen. Wenn transkleinerung, Desinfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Optifect: DNA-Platten. Decken-Zellen.
5. Zentrifugieren der Zellplatten bei 1200 × g für 30 min. Decken und zurück in den Inkubator.
6. Inkubieren Sie die Zellen für 4-6 Stunden. Während dieser Inkubation bereiten frische Medien durch Mischen von 12 ml DMEM mit 10% FBS und 10 pg / ml Ciprofloxacin (CellGro) für jede Bibliothek transfiziert Platte. Gießen Sie frisches Medium in einem sterilen Behälter.
7. Platz 2 Boxen der Roboter-Tipps, eine einzige Platte von Zellen, das Reservoir mit frischem Medium und einen Abfallbehälter auf der Roboterplattform. Aspirat 100 ul Medium aus den Zellen und Abgabe in den Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Mit frischen Tipps, absaugen 100 ml frisches Medien und langsam auf die Zellen zu verzichten. Wiederholung für alle Platten der Zellen.
8. Rückgabe Platten in den Inkubator für 48 Stunden.

4. Führen Dual-Luciferase-Assays

Am Tag 4 des Bildschirms, dieGlühwürmchen-und Renilla-Luciferase-Assays durchgeführt werden.

Hinweis: Die Dual-Luciferase-Assay erfordert die sequentielle Zugabe von 2-Assay-Puffer, 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und 3X Renilla Assaypuffer, wie in Tabelle 3 beschrieben Firefly Luciferase und Renilla nicht sezerniert wird, so müssen die Zellen vor der Messung der Luciferase-Aktivität, lysiert werden. . Firefly-Assay-Puffer lysiert Zellen und bietet Substrat für die Firefly Luziferase; Renilla-Assay-Puffer löscht den Glühwürmchen-Signal und liefert Substrat für die Renilla-Luciferase.

1. Für jede Bibliothek Platte, bereiten 8 ml 3X Glühwürmchen Testpuffer aus Stammlösungen, wie in Tabelle 3 beschrieben, und verzichten 82 ul in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte.
2. Für jede Bibliothek Platte, bereiten auch 12 ml 3X Renilla-Assay-Puffer und 122 ul verzichten in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte. Beiseite sowohl dieGlühwürmchen und Renilla-Assay-Puffer.
3. Legen Sie ein Feld von Pipettenspitzen, ein Abfallbehälter und 2 Platten von Zellen (aus derselben Bibliothek Platte transfiziert) auf der Roboterplattform.
4. Saugen Sie 60 ul Medien von jeder Platte und entsorgen in der Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Deckplatten und beiseite stellen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Sätze Teller.
5. Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform.
6. Saugen Sie 40 ul 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf neue Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Zeigen Zellen bei RT für 10 min, um die Lyse zu vervollständigen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Boxen von Tipps und Zellplatten, und wiederholen.
7. Rekord Lumineszenz aus jeder Vertiefung jeder Zelle Platte auf einem Luminometer, Aufzeichnung für 1 Sekunde pro Vertiefung. Rückgabe Platten auf den RoboterDeck.
8. Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Renilla-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform.
9. Saugen Sie 60 ul 3X Renilla-Assay-Puffer, und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf eine neue Box von Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Gruppen von Zellplatten.
10. Rekord Lumineszenz von allen Platten auf einem Luminometer, Aufzeichnen jeder gut 1 Sekunde wie oben. Entsorgen Platten.

5. Data Analysis

1. Berechnen Sie die Glühwürmchen: Renilla-Lumineszenz-Verhältnis ("F: R-Verhältnis") für jede gut durch Teilung des Grafen von Glühwürmchen-Signal von den Grafen von Renilla-Signal.
2. Berechnung der Induktion durch Teilen der F R-Verhältnis jedes vom durchschnittlichen F: R-Verhältnis der Platte, mit Ausnahme der höchsten und der niedrigsten 25% der Vertiefungen.
3. Mittelwert der Induktionswerte über Wiederholungenfür eine einzelne Bibliothek transfiziert Platte. Gene induzieren oder Unterdrückung alpha-Synuclein mehr als drei Falten werden in diesem Bildschirm als "Treffer" und unterliegen weiteren Validierung und sekundären Bildschirmen.

Ergebnisse

Typische Luciferase-Werte, F: R-Verhältnisse und Induktion Werte für ein einzelnes Halbplatte sind in Abbildung 4 dargestellt Beachten Sie die Hit in gut H2, einem 32-fach-Induktor.. Gene verursacht übermäßige Toxizität (z. B. auch E3), oder Brunnen, die schlecht transfiziert wurden, werden niedrige Werte sowohl für Glühwürmchen und Renilla Luciferase produzieren, aber eine durchschnittliche Induktionswert. Genen, die nicht-spezifische Induktion der Luciferase-Aktivität, möglicherwei...

Diskussion

Alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit (PD) als Bestandteil der Lewy-Körper ^4, intrazellulären Einschlüssen als pathognomonisch für die Krankheit in Verbindung gebracht. Zahlreiche genomweiten Assoziationsstudien haben Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Alpha-Synuclein mit einem erhöhten Risiko für sporadische PD ^5,6,7 verbunden. Obwohl weniger verbreitet als sporadische PD, familiäre PD kann auch durch Mutationen im Alpha-Synuclein ⁸ verursacht werden, sowie Vervielfältigung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Material
QIAQuick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR Micro Kit	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K2100-07
Bravo Robot	Agilent	-
Robot Pipet Tips with Filter	Agilent	19477-022
Robot Pipet Tips without Filter	Agilent	19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates	Corning	3610
Reservoirs	Axygen	RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate	Greiner	651201
Adhesive Plate Covers	CryoStuff	#FS100
			Reagent
Phusion DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase	Roche	10713023001
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265-017
DMEM without Phenol Red	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
Ciprofloxacin	CellGro	61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder	Sigma	93287
Tris-Base Powder	Sigma	93286
Triton X-100 Pure Liquid	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
Coenzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
Luciferin	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003