Method Article
Somitogenesis هو عملية التنموية الإيقاعية التي مكانيا أنماط محور الجسم من أجنة الفقاريات. سابقا، قمنا بتطوير خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تستخدم للصحفيين الفلورسنت لمراقبة الجينات التي تدفع دوري هذه العملية. هنا، ونحن ثقافة فرقت الخلايا من هذه الخطوط والصورة التذبذبات على مر الزمن في المختبر.
تجزئة هو عملية التخلق دورية ومتتابعة في الفقاريات. هذا التشكيل الإيقاعي من كتل من الأنسجة تسمى somites على طول محور الجسم هو دليل على وجود مذبذب الوراثية الزخرفة الجنين النامية. في الزرد، وتتكون على مدار الساعة داخل الخلايا تجزئة الدافعة للأعضاء عامل النسخ عائلتها / هس تنظيمها في الحلقات ردود فعل سلبية. لقد ولدت مؤخرا المعدلة وراثيا خطوط مراسل الفلورسنت لher1 الجين دوري أن ألخص نمط المكانية والزمانية من التذبذبات في الأديم المتوسط presomitic (PSM). باستخدام هذه الخطوط، قمنا بتطوير نظام الثقافة في المختبر الذي يسمح التحليل في الوقت الحقيقي من خلال تجزئة التذبذبات على مدار الساعة، والخلايا المعزولة PSM احد. عن طريق إزالة الأنسجة PSM من الأجنة وراثيا ومن ثم تفريق الخلايا من المناطق تتأرجح على الأطباق الزجاجية القاع، ونحن ولدت الثقافات مناسبة للالوقت الفاصل بين التصوير من إشارة مضان منالخلايا الفردية على مدار الساعة. ويوفر هذا النهج إطارا التجريبية والمفاهيمية للتلاعب المباشر على مدار الساعة لقرار تجزئة وحيدة الخلية غير مسبوقة، مما يسمح للخصائص خلية مستقلة وعلى مستوى الأنسجة لتمييزها وتشريح.
تشكيل دورية للقطاعات على طول محور الجسم الفقاريات، أو somitogenesis، هو دليل على وجود مذبذب المكانية والزمانية في الجنين النامية. آلية يفضل السيطرة somitogenesis والمفاهيمية وصفها ب "على مدار الساعة واجهة الموجة" نموذج 1، حيث "ساعة" التي تتألف من مؤشرات التذبذب الخلوية، ويعتقد الآن أن تكون مدفوعة من قبل داخل الخلية التعبير الايقاعي من مجموعة من الجينات دوري 2، القراد قبالة تشكيل من somites من الأديم المتوسط presomitic (PSM). مع تطور الجنين، والنضج "واجهة الموجة" في PSM يتحرك بالتنسيق مع الأنسجة تراجع نحو الخلفي، وتباطؤ واعتقال مؤشرات التذبذب الخلوية لأنها تمر 3. معا، ويطلق على هذا النظام الديناميكي spatiotemporally على مدار الساعة تجزئة. النهج الحالي لدراسة تجزئة مدار الساعة فترة ثلاثة مستويات متزايدة من التنظيم من مذبذب الوراثية في الخلايا واحد إلى عشرة اقتران المحليةفي يحدث بين الخلايا، وأخيرا إلى التنظيم العالمي للمعلومات الموضعية في PSM الأنسجة الجماعية 4.
وتشير الدراسات السابقة إلى تجزئة مذبذب خلية مستقلة في الزرد يتكون من الجينات ومنتجات البروتين من النسخ لها / هس] factorfamily، التي يعتقد أنها تشكل رد الفعل السلبي من خلال القمع النسخي 5-7. إشارات الطريق دلتا / الشق بمزامنة التذبذبات بين الخلايا المجاورة وينظم الفترة الجماعي للسكان 8-10. جمعية جيل المستقبل تظهر إشارات الجزيئات التي تنتج في tailbud لبناء التدرج عبر PSM الزرد، وبالتالي افترض أن تساهم في تباطؤ واعتقال خلايا تتأرجح في 11 الأمامي. حتى الآن، وقد تم التحقيق في الأدوار الوظيفية لكل من هذه الجزيئات في somitogenesis التي كتبها طفرة جينية، حقن morpholino الحرارية صدمة الإفراط في التعبير، وخصم trea المخدراتtment من مكونات مدار الساعة والإشارات بين الخلايا 5،7،10،12. باستخدام هذه الاضطرابات، وقد يستدل تجزئة ظيفة على مدار الساعة من أوصاف مستوى الأنسجة من العيوب الجسيدة وفقدان التذبذبات موحدة في التعبير عن الجينات دوري مثل her1، her7، ودلتا C. ومع ذلك، وكلها تقريبا من هذه البيانات هي من أجنة الثابتة وتفشل في التقاط بدقة التغييرات التي هي متأصلة في وظيفة حيوية على مدار الساعة تجزئة. في الآونة الأخيرة، كشفت متعددة الأجنة الوقت الفاصل بين التصوير المسوخ الأولى مع الفترة مذبذب تتغير، ولكن قدمت هذه الملاحظات أيضا على مستوى 7،13 الأنسجة. وبالتالي، لم يحترم سلوك مذبذب خلايا مستقلة افترض خلال somitogenesis.
لقطات ثابتة من somitogenesis إعطاء صورة مكتملة لأنه، بطبيعته، هو الدافع وراء العملية من خلال نظام متذبذبة. أظهر العمل في وقت سابق من خلايا فأر وفرخ أن مستويات النصوارتفاع البروتين والخريف، ولكن أخذ العينات التذبذب ما يقرب من 2 ساعة كل 30 أو 45 دقيقة يقيد بالضرورة البيانات التي تم جمعها، وبالتالي فإن الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها 14،15. دراسة مؤشرات التذبذب البيولوجية الأخرى، وأبرزها، والساعات الإيقاعية، تحركت بعيدا عن قياسات نظم الجينات والبروتينات التعبير لرصد الوقت الحقيقي باستخدام الفلورسنت وصحفيين للإضاءة الحيوية 16،17. هذه الأدوات ضرورية لإظهار الخصائص على مدار الساعة من الخلايا واحد 18. وقد تم تطوير مراسل إضاءة الحيوية للجين دوري Hes1 وتتميز الخلايا واحد في الماوس PSM 19 لفترة وجيزة. تم حساب متوسط فترة والتباين لعدد صغير من الخلايا، وتبين أن التذبذبات تستمر لعدة دورات في المختبر. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لم تتناول كميا استقرار ومتانة تردد المذبذب والسعة، ما إذا كانت الخلايا يمكن أن تدخل بشكل عفوي أو التذبذبات الخروج،وكيف تحافظ على خلايا العلاقات مرحلتها. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم اختبارها آثار إشارات الجزيئات الموجودة في الجنين على مدار الساعة خلية مستقلة مباشرة. وبالتالي، هذه الخصائص الأساسية للمذبذب خلية واحدة لا تزال مجهولة تماما.
وقد وضعنا مؤخرا خطوط الأسماك المعدلة وراثيا باستخدام BAC recombineering 20 لدفع فينوس (YFP) للصحفيين مضان من her1 التعبير 30. هذه الخطوط استغلال العظة التنظيمية للموضع الكروموسومات سليمة التي تضمهم وألخص ديناميات الزماني والمكاني للنمط her1. هذا اختراق يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من التعبير الجيني في الجنين الزرد النامية في الجسم الحي. لدراسة الخصائص الأساسية للالتذبذبات خلية مستقلة وكيف يتم تنظيم مثل هذا التعبير مع مرور الوقت، ونحن في الآونة الأخيرة وضعت طريقة موثوق بها لعزل وسجل من الخلايا في المختبر PSM. هذا بروتوويصف العقيد كيف يمكننا استخدمت خطوط مراسل المعدلة وراثيا لدينا لتوليد مزارع الخلايا المشتتة، يمكننا من خلاله توصيف التذبذبات على مدار الساعة تجزئة الزرد في الخلايا واحد. يمكننا بالتالي معالجة المسائل العالقة في الحقل الذي لم تكن في متناول مع تحليل ثابتة أو على مستوى الأنسجة، فضلا عن التلاعب مباشرة على مدار الساعة تجزئة على مستوى خلية واحدة مع إشارات الجزيئات ومثبطات.
1. قبل تشريح
2. PSM تشريح والتشتيت
3. التصوير من خلايا متناثرة PSM
4. معالجة الصور من الأفلام متلازمة الوقت الفاصل
هذا البروتوكول تنتج ثقافات، وفرقت، وخلايا PSM واحدة قابلة للالوقت الفاصل بين التصوير من إشارة مضان (الشكل 2). لدينا التحوير يولد مراسل الذين دورة الإنتاج وتدهور تحدث مع ديناميات مماثلة لهذا الجين الذاتية والبروتين في الجنين، بناء على أمر من نصف ساعة. بسبب دوران سريع لها، ويجب أن يتم الكشف عن إشارة YFP في الخلايا واحد بسرعة لتقليل تبيض ومع القرار الزماني عالية لالتقاط ملامح كل دورة متذبذبة. أيضا، بالنظر إلى الخفوت النسبي للإشارة، تم ضبطها الظروف الثقافة واكتساب بعناية لضمان نتائج حساسة وقوية. لقد تم العثور على العوامل التالية إلى أن تكون مهمة في توليد الأمثل الثقافات الخلية PSM للتصوير: 1 إن الركيزة ECM تستخدم لطلاء الأطباق ثقافة أسفل الزجاج. 2. إضافة مصل للتشريح والمتوسطة التصوير. 3. تشريح PSM من الأجنة التي تم تحديدها اتخذت بعد التزاوج HETEأزواج rozygous، التي يحتمل أن تكون ذرية تحمل 2 نسخ من التحوير. 4. اقتناء صورة ضمن نطاق التكبير الأمثل، وذلك باستخدام الهدف NA أعلى لضمان كفاءة التقاط إشارة مضان. 5. الإضاءة مع مصدر ضوء الحالة الصلبة للحد من تقلبات الكثافة التي يمكن أن تسهم في ضجيج الخلفية. 6. كشف الإشارات مع كاميرا حساسة للغاية EM-CCD لتعظيم إشارة قراءات.
والثقافات الفرعية الأمثل تحتوي على الخلايا التي لا تبقى مدورة وصحية في جميع أنحاء التسجيل. افترضنا أن لدينا الركيزة ECM، جزء من fibronectin1 الزرد تبقي الخلايا في PSM مثل حالة غير متمايزة، بالمقارنة مع غيرها من ركائز استخداما مثل بولي يسين أو laminin. ركائز أخرى اختبرنا تسبب الخلايا للشد على الزجاج وفقدان إشارة الفلورسنت تتأرجح على مدار التسجيل. وجدنا أيضا أن إضافة مصل إلى متوسطة أثناء تشريح، تشتت،وكان تسجيل ليس فقط مهم لإرواء التربسين المستخدمة لتفارق، ولكن أيضا زيادة كثافة مضان على الخلفية، على الأرجح بسبب تحسن بقاء الخلية. لضمان التقاط إشارة الأمثل من الخلايا واحد كنا هدفا 40X مصممة خصيصا للتصوير مضان (زايس خطة NeoFluor سلسلة) مع ارتفاع NA. وجدنا أيضا أن مصدر ضوء الحالة الصلبة تقديم إضاءة أكثر استقرارا من مصابيح الزئبق التقليدية، وهو أمر حاسم للحد من تقلبات الخلفية التي تسهم في الصور صاخبة. هذه التعديلات مهمة لضمان تحقيق نتائج قوية.
باستخدام هذا البروتوكول نتوقع الثقافات التي يتم فلوري غالبية الخلايا في مجال معين في مرحلة ما أثناء التسجيل. نجد أن الخلايا الفلورسنت تبقى عادة مدورة وأحيانا متحركة جدا خلال التسجيلات. وهناك عدد قليل الخلايا، بما في ذلك الخلايا الفلورسنت، قد تصبح أفكارك أثناء التسجيل. وتستبعد هذه الخلايا من أي أحدnalysis. نحن أيضا استبعاد الخلايا التي تتلامس مع خلايا أخرى أو نقلها خارج مجال الرؤية. في المتوسط، ونحن نرى انخفاضا بنسبة 12٪ في عدد الخلايا لكل حقل من نهاية التسجيل 10 ساعة كما تم قياسها عن طريق حساب عدد الخلايا السليمة في القناة الضوء المرسل. وتشمل هذه الخسارة على حد سواء موت الخلايا والخلايا التي انتقلت من مجال. ونظرا لهذه المحاذير وسعنا، في المتوسط، المسار 5 خلايا لكل حقل الفلورسنت التي لا تزال قابلة للحياة ومرئية، وعادة ما تسجل 6 حقول في الشرط. على سبيل المثال، سوف تجربة مع 4 شروط دينا 24 مجموع الحقول المكتسبة وعادة حوالي 30 خلية في تعقب الشرط. في ظل ظروف التصوير القياسية مع L15 المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، نجد أن الخلايا PSM (ن = 101 الخلايا من 4 مكررات التجريبية) يمكن أن تنتج ما بين 2 و 7 قمم، مع متوسط والانحراف المعياري 3 ± 1 قمم (2 دورات -3). عدد الذروة الوسيط، وكذلك المئين 25٪، هو 2 القمم و75٪ المئين طق 3 قمم. باستخدام لدينا تتبع وتحليل شبه الآلي، ونحن يمكن أن تولد بسرعة كثافة مضان على آثار الوقت لخلايا PSM الفردية، مع اثر خلية ممثل هو مبين في الشكل 2C. ويمكن بعد هذه آثار الخام أن تستخدم لجعل القياسات الكمية من خصائص الخلايا PSM تتأرجح، مثل تردد، والسعة، وعدد الدورات، وتوقيت القمم.
الشكل 1. تحديد الأجنة والخطط المعدلة وراثيا من تشريح بهم. (A) عرض الجانبي للجنين الزرد المعدلة وراثيا معربا عن YFP مضان في مرحلة ~ 5 الجسيدة. الصورة تراكب الضوء المرسل وقناة مضان. السهام تشير إلى مجالات إشارة البدء في غيض من tailbud، في جميع أنحاء PSM، نحو لتر AST شكلت الجسيدة. يظهر أقحم التخطيطي من التحوير مراسل (لمزيد من المعلومات حول تطوره والسلوك في الجسم الحي الرجوع إلى Soroldoni وآخرون 30. (B) تخطيطي للعرض الوحشي من الجنين قبل أن يقطع لأول مرة خلال تشريح. يشير خط أحمر منقط في أول خطوة من نوعها قدمت عبر الدماغ المؤخر، على الرغم من الخلية صفار فقط وراء tailbud. (C) عرض تخطيطي بالارض PSM التالية إزالة حبيبات الصفار وطبقة البشرة، الموجهة على طول المحور الأمامي الخلفي لها. يشير خط أحمر منقط خفض ثانية لإزالة غيض من tailbud للتشتت والثقافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
07fig2.jpg "/>
الشكل 2. صور الممثل وآثار من خلية واحدة في ثقافة PSM فرقت. (A) مونتاج الصور المنقولة من ضوء خلية PSM واحد في 6 ساعات تسجيل الوقت الفاصل. لاحظ أن الخلية ما زالت مدورة وصحية طوال فترة التسجيل. (B) الموافق المونتاج من الصور مضان من خلية واحدة PSM. يتم ترقيم قمم في كثافة الخلية على مدار التسجيل. (C) متوسط الكثافة مع مرور الوقت يقاس من العائد على الاستثمار وضعت على هذه الخلية. تؤخذ القيم من كل إطار من الفيلم مع معدل الإطار الواحد في 2 دقيقة باستخدام دائرة interpolator المكونات في وماكرو مخصصة مكتوب في فيجي. يتم ترقيم قمم في شدة مرة أخرى في جميع أنحاء التتبع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
لدراسة عملية الخلوية التي تجري على مدى التطور الجنيني، وعلماء الأحياء عادة استخدام هذا النهج في سياق الجنين بأكمله. ومع ذلك، ولكي نفهم تماما كيف يتصرف خلية واحدة ضمن إطار زمني التنموية، وهي طريقة لدراسة والتشويش على الخلايا الفردية في عزلة هو أيضا مفيد للغاية. عن طريق توليد فرقت الثقافات الخلية PSM باستخدام الأجنة الزرد المعدلة وراثيا لدينا الآن أداة لدراسة الخلية مباشرة الطابع المستقل من التذبذبات الوراثية في ساعة تجزئة بطريقة الكمي. فمن الممكن لقياس ديناميكية التذبذبات في مراسل الفلورسنت لدينا في مئات من الخلايا تحت مجموعة متنوعة من الظروف.
فترة احظ واحد من الخلايا في الثقافة أطول من الفترة somitogenesis في الجنين سليمة. نلاحظ أن ازدراع PSM سليمة في الثقافة يسلك أيضا التذبذبات أبطأ من الجنين سليمة (لا تظهر البيانات)، مما يوحي ثار فترة أطول لوحظ في خلايا معزولة لا يعود ببساطة إلى الأضرار الناجمة عن تشتت. ويلاحظ وجود فترة متغير والسعة في معظم لدينا وحيدة الخلية سلسلة زمنية. مصدر هذا التباين هو معروف، ولكن ينبغي أن تكشف تفاصيل مهمة عن دوائر صنع تيرة على مدار الساعة في تجزئة.
مع هذا الأسلوب يمكننا دراسة المكونات الجينية للتجزئة على المستوى الخلوي، والأسئلة العنوان الذي يتحدون لدراسة في الجنين كله. على سبيل المثال، من خلال إضافة للرقابة من جزيئات إشارة معروفة وجدت في الجنين النامية لثقافاتنا، يمكن أن ندرس آثارها على PSM مذبذب الخلوية واحد في مقايسة قوية وقابلة للتكرار. يفتح نظامنا الثقافة PSM الباب أمام إجراء تقييم دقيق للعوامل ما، وحده، أو بالاشتراك تعزيز التذبذبات في هذه الخلايا، ما هي العوامل التي تحول دون هذه التذبذبات، واختبار التفاعل بين هذه الجزيئات. مع هذه الأدوات في متناول اليد، ونحن نهدف إلىتقييم النماذج القائمة من somitogenesis التي تستند إلى بيانات على مستوى الأنسجة المنشورة، فضلا عن نتائج استخدام في الخلايا وحيدة لتوليد التنبؤات التي يمكن اختبارها في الجنين كله.
على حد علمنا، هذا هو أول الزرد بروتوكول الثقافة الخلية الأولية للالحاد تسجيل الوقت الفاصل بين مضان في الخلايا واحد؛ مزيد من التطوير والتنقيح من هذا البروتوكول هو بلا شك ممكن. بروتوكولات أخرى غالبا ما تستخدم الأجنة الزرد لتوليد خطوط الخلايا المستقرة التي يمكن transfected مع صحفيين وتستخدم للتصوير على المدى الطويل 27-29. بينما خطوط مستقرة هي مفيدة لتصوير عملية ليست مرتبطة توقيت التنمية، مثل الساعة اليومية، مسألة تجزئة الجنينية يتطلب التصوير على الفور في حين أن الخلايا لا تزال في متذبذبة، دولة السلف الخاصة بهم. مرة واحدة خلايا وقف تتأرجح، فإنها تفترض مصير الخلايا المتمايزة، وعندما تكون في الأنسجة، وستدرج في الجسيدة. فمن بوssible أنه مع عامل الحق أو عوامل موجودة في المختبر فإننا يمكن أن تولد الزرد خطوط خلية ثقافة PSM مثل التي من شأنها أن تبقى متذبذبة، مما يتيح بشكل ملحوظ الملاحظات على المدى الطويل، اضطرابات متتابعة متعددة، أو الفرز الفائق الإنتاجية.
ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب في إعداد الثقافات الأولية من خلايا متناثرة للتصوير مرور الزمن هو مناسبة تماما لدراسة أي عملية الخلوية التي تحدث ضمن إطار زمني التنموية التي ليس دود باستخدام خطوط الخلايا الزرد مستقرة. عزلة متميزة الخلية الأنواع في مراحل نمو متميزة من خطوط مراسل المعدلة وراثيا المناسب، إما عن طريق تشريح أو عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد التفكك الجنينية، يمكن أن توفر الخلايا تبدأ. بعض التحسين من ظروف الثقافة، مسترشدة في ذلك المنشأ الجنينية من الخلايا، قد تكون مطلوبة. من خلال الجمع بين هذا البروتوكول مرنة وحساسة مع مجموعة متنامية بسرعة من الزرد المعدلة وراثياخطوط، ونحن نأمل أن تسهل في المختبر التنموية نهج البيولوجيا التي هي مكملة لأساليب الوراثية والجنينية الكلاسيكية.
المؤلف المساهمات:
ABW تطوير وصقل تشتت، والثقافة، والتصوير، والبروتوكولات تتبع الخلية. DS إنشاء خطوط المعدلة وراثيا وأشرف على تصميم المجهر مضان الوقت الفاصل المستخدمة في هذا البروتوكول. رائدة AO الأولي إثبات صحة المبدأ التجارب لفصل الخلايا والصورة PSM في الثقافة. كتب JS الأداة المساعد دائرة interpolator في فيجي تستخدم لقياس كثافة مضان من الأفلام مرور الزمن. ABW وأكو كتب مخطوطة.
وأيد هذا العمل من قبل EMBO طويل الأجل الزمالة (ABW)، وزمالة الدولية المؤسسة الوطنية للعلوم ما بعد الدكتوراه البحوث (ABW)، وماكس بلانك غزلشافت (ABW، DS، JS، أكو)، وهو يحفر-BB الزمالة (AO)، ومجلس البحوث الأوروبي في إطار الإطاري السابع المجتمعات الأوروبية برنامج STG-207634 (DS، أكو). نشكر رافي ديساي للتعليقات مفيدة على المخطوطة. نود أيضا أن نشكر MPI-CBG مرفق تعبير البروتين لإنتاج Fibronectin1 جزء الزرد، وموظفي مرفق الأسماك MPI-CBG للرعاية وصيانة خطوط الأسماك لدينا وMPI-CBG مرفق المجهر الضوئي للحصول على الدعم التصوير.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | |||
Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved